管 瑩，夭建華，高 茜，曾婉俐，黃海濤，李雪梅，繆明明

(云南煙草科學(xué)研究院，云南 昆明 650106)

體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)作為一類(lèi)重要的體外試驗(yàn)，在新藥研發(fā)以及化學(xué)物質(zhì)毒性評(píng)價(jià)方面均發(fā)揮著重要的作用。中性紅比色法和噻唑藍(lán)(MTT)比色法是目前應(yīng)用較多的兩種毒理學(xué)檢測(cè)細(xì)胞毒性的方法，具有簡(jiǎn)便、快捷、靈敏等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于評(píng)定食品、藥品、化妝品對(duì)細(xì)胞的毒性作用[1～7]。

據(jù)報(bào)道[6～10]，由于使用的細(xì)胞種類(lèi)不同，細(xì)胞毒性試驗(yàn)中適合的細(xì)胞初始接種密度存在較大差異。本實(shí)驗(yàn)室實(shí)際檢測(cè)工作中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞毒性試驗(yàn)定量測(cè)定結(jié)果的變異較大，可比性較差，而細(xì)胞初始接種密度可能是影響定量測(cè)定結(jié)果的重要因素，但未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。鑒于此，為了提高中性紅比色法和MTT比色法體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的半定量或定量檢測(cè)的可靠性和可比性，作者就CHO細(xì)胞初始接種密度對(duì)中性紅比色法和MTT比色法體外細(xì)胞毒性試驗(yàn)的影響進(jìn)行了比較，旨在為運(yùn)用中性紅比色法和MTT比色法對(duì)化學(xué)品、食品等受試物的毒理學(xué)檢測(cè)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑和儀器

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞(CHO細(xì)胞)，中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所。

DMEM/F12(Solarbo公司)，胎牛血清(美國(guó)Klark)，PBS，胰酶，中性紅(Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO)。

96孔及24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Forma公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Rod公司)，Borgwaldt RM20/CS型半自動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán)式吸煙機(jī)。

1.2 受試物的制備

按國(guó)標(biāo)方法[11]，利用半自動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán)式吸煙機(jī)抽吸40支標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試用美國(guó)肯塔基卷煙3R4F，用直徑92 mm的劍橋?yàn)V片捕集燃吸后產(chǎn)生的煙氣總粒相物(TPM)；將劍橋?yàn)V片放入三角瓶中，加入適量DMSO，使TPM在DMSO中的濃度為10 mg·mL-1；超聲20 min；過(guò)濾收集TPM提取液；儲(chǔ)存于-80 ℃，備用。

1.3 細(xì)胞的傳代培養(yǎng)

將CHO細(xì)胞按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)：DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含10%胎牛血清)，37 ℃，5%CO2。

1.4 細(xì)胞倍增時(shí)間的測(cè)定

取CHO對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化，吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別以細(xì)胞密度(×104個(gè)·mL-1)為2、4、6、8、10接種于24孔板中，每孔0.5 mL，分別于24 h、48 h各取3孔，棄去培養(yǎng)液及未貼壁細(xì)胞，加入1 mL PBS洗2次后去上清，用胰酶消化貼壁細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。按式(1)計(jì)算細(xì)胞倍增時(shí)間(tD)[8]：

(1)

式中：tD為t1～t2時(shí)間范圍內(nèi)細(xì)胞的倍增時(shí)間；n1為t1時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)；n2為t2時(shí)刻的細(xì)胞數(shù)[13]。

1.5 中性紅比色法測(cè)定受試物對(duì)細(xì)胞的抑制率

取CHO對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化，吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別以細(xì)胞密度(×104個(gè)·mL-1)為2、4、6、8、10接種于96孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入受試物，受試物終濃度(μg·mL-1)分別為50、100、120、140、160、200、300，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入濃度為100 μg·mL-1的中性紅DMEM無(wú)血清培養(yǎng)液，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h；去除中性紅溶液，加入1%的甲醛溶液200 μL，固定1 min；去除固定液，每孔加入200 μL中性紅萃取液(現(xiàn)配，水∶乙醇∶乙酸=49∶50∶1)，置于微量振蕩器上振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)量540 nm處吸光度值。按式(2)計(jì)算細(xì)胞抑制率(X)：

(2)

式中：ODn為樣品多孔平均OD值；OD0為空白多孔平均OD值；ODc為對(duì)照多孔平均OD值[14]。

1.6 MTT比色法測(cè)定受試物對(duì)細(xì)胞的抑制率

取CHO對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶進(jìn)行消化，吹打均勻，細(xì)胞計(jì)數(shù)后分別以細(xì)胞密度(×104個(gè)·mL-1)為2、4、6、8、10接種于96孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入受試物，受試物終濃度(μg·mL-1)分別為50、100、120、140、160、200、300，每個(gè)濃度6個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；加入濃度為5 mg·mL-1的MTT溶液，每孔20 μL，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h；去除溶液，加入DMSO溶液，每孔200 μL，置于微量振蕩器上振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)量490 nm處吸光度值。計(jì)算細(xì)胞抑制率。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0軟件的one-way ANOVA功能進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 CHO細(xì)胞初始接種密度對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間的影響(圖1)

圖1 CHO細(xì)胞初始接種密度對(duì)細(xì)胞倍增時(shí)間的影響

由圖1可知，各濃度組在24 h內(nèi)細(xì)胞倍增時(shí)間無(wú)明顯差異(P>0.05)，大約10～15 h增殖一代。而細(xì)胞培養(yǎng)第48 h時(shí)，8×104個(gè)·mL-1與10×104個(gè)·mL-1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯減慢，分別為28 h和37 h左右增殖一代；2×104個(gè)·mL-1、4×104個(gè)·mL-1、6×104個(gè)·mL-1實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)速度與培養(yǎng)24 h相近，仍然為10～15 h增殖一代。因此，以初始密度2×104～6×104個(gè)·mL-1接種細(xì)胞，CHO在連續(xù)48 h的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)細(xì)胞增殖速度較為穩(wěn)定。

2.2 CHO細(xì)胞初始接種密度對(duì)中性紅比色法測(cè)定受試物的細(xì)胞抑制率的影響(圖2)

圖2 CuSO4(a)和TPM(b)對(duì)不同初始接種密度CHO細(xì)胞的抑制率

由圖2可知，隨著細(xì)胞初始接種密度的降低，兩種受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率均呈升高趨勢(shì)。

利用SPSS 16.0軟件中的LSD多重比對(duì)法，對(duì)CuSO4及TPM兩種受試物在劑量(μg·mL-1)為50、100、120、140、160、200、300時(shí)對(duì)CHO細(xì)胞初始接種密度(×104個(gè)·mL-1)為10、8、6、4、2的細(xì)胞抑制率進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1CuSO4和TPM對(duì)不同初始接種密度CHO細(xì)胞的抑制率的方差分析

Tab.1Varianceanalysis(Pvalue)ofinhibitionrateofCHOcellswithdifferentinitialseedingdensitiestreatedbyCuSO4andTPM

受試物初始接種密度/個(gè)·mL-1P值8×104個(gè)·mL-16×104個(gè)·mL-14×104個(gè)·mL-12×104個(gè)·mL-1CuSO410×1048×1046×1044×1040.8200.7800.9590.4010.5390.5740.0250.0410.0460.143TPM10×1048×1046×1044×1040.8240.7700.6070.2600.1800.4010.0200.0120.0390.205

由表1可知，受試物為CuSO4或TPM時(shí)，2×104個(gè)·mL-1實(shí)驗(yàn)組與10×104個(gè)·mL-1、8×104個(gè)·mL-1、6×104個(gè)·mL-13個(gè)實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞抑制率間存在顯著差異(P<0.05)；10×104個(gè)·mL-1、8×104個(gè)·mL-1、6×104個(gè)·mL-1、4×104個(gè)·mL-14個(gè)實(shí)驗(yàn)組間細(xì)胞抑制率均無(wú)顯著差異(P>0.05)。

上述結(jié)果表明，兩種受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率隨細(xì)胞初始接種密度的降低均呈升高的趨勢(shì)，當(dāng)CHO細(xì)胞的初始接種密度為4×104～10×104個(gè)·mL-1時(shí)用中性紅比色法測(cè)定的同一受試物對(duì)細(xì)胞的抑制率相對(duì)穩(wěn)定，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)顯著差異(P>0.05)。

2.3 CHO細(xì)胞初始接種密度對(duì)MTT比色法測(cè)定受試物的細(xì)胞抑制率的影響(圖3)

圖3 MTT比色法測(cè)定不同初始接種密度CHO細(xì)胞的吸光度

通常情況下用MTT比色法進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的線性，MTT在490 nm處的吸光度值最好在0～1.2范圍內(nèi)。由圖3可知，除2×104個(gè)·mL-1、4×104個(gè)·mL-1實(shí)驗(yàn)組MTT吸光度值低于1.2外，其余3組的吸光度值均超出了線性范圍。

2.4 討論

(1)細(xì)胞毒性試驗(yàn)通常采用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，這是由于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞代謝旺盛、生長(zhǎng)迅速、代時(shí)穩(wěn)定，個(gè)體形態(tài)、化學(xué)組成和生理特性等均較一致，利用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)有利于比較試驗(yàn)結(jié)果。無(wú)論是中性紅比色法還是MTT比色法，細(xì)胞毒性試驗(yàn)的周期均為48 h，而受試物是在細(xì)胞完全貼壁后加入，即細(xì)胞接種后24 h，因此，培養(yǎng)48 h細(xì)胞的穩(wěn)定增殖對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性的影響尤為重要。本研究利用細(xì)胞倍增試驗(yàn)對(duì)CHO細(xì)胞不同初始接種密度下48 h內(nèi)的細(xì)胞倍增時(shí)間進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示以2×104～6×104個(gè)·mL-1的初始接種密度接種細(xì)胞，細(xì)胞在連續(xù)48 h的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)生長(zhǎng)速度較為穩(wěn)定。而以較高初始密度(8×104～10×104個(gè)·mL-1)接種細(xì)胞，由于生長(zhǎng)空間有限，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到飽和密度后，細(xì)胞間的接觸抑制作用導(dǎo)致細(xì)胞增殖減慢，細(xì)胞停止生長(zhǎng)，進(jìn)入平臺(tái)期，這不利于試驗(yàn)結(jié)果的比較。

(2)隨細(xì)胞初始接種密度的降低，CuSO4和TPM兩種受試物對(duì)CHO細(xì)胞的抑制率均呈升高趨勢(shì)。這可能是由于，細(xì)胞初始接種密度不同，同一濃度的受試物對(duì)于實(shí)際受試細(xì)胞個(gè)體來(lái)說(shuō)所需要承受的相對(duì)劑量是不同的。細(xì)胞越少，同樣濃度的受試物相對(duì)每個(gè)受試細(xì)胞來(lái)說(shuō)所需要承受的劑量越高。不同的細(xì)胞毒性試驗(yàn)其最適細(xì)胞初始接種密度有所不同。中性紅比色法的最適細(xì)胞初始接種密度比MTT比色法高，這可能是由于中性紅比色法細(xì)胞毒性試驗(yàn)過(guò)程中比MTT比色法多了清洗和固定等步驟，對(duì)細(xì)胞有一定損耗，因此細(xì)胞初始接種密度應(yīng)適當(dāng)提高。

(3)目前關(guān)于化學(xué)物質(zhì)細(xì)胞毒性的研究報(bào)道中，由于各研究目標(biāo)樣品的靶器官不同，所選擇的細(xì)胞也有所差異。例如王明衡等[9]選取HL-7702肝細(xì)胞對(duì)食品添加劑亞硫酸鈉的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測(cè)，細(xì)胞初始接種密度為2.5×105個(gè)·mL-1；而蘇建青等[7]選擇雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)對(duì)人參皂角促細(xì)胞增殖作用進(jìn)行了檢測(cè)，細(xì)胞初始接種密度為1×106個(gè)·mL-1。由此可見(jiàn)，細(xì)胞毒性試驗(yàn)由于使用的細(xì)胞種類(lèi)不同，具體選用的細(xì)胞初始接種密度也有所差異，且范圍較大[6～10]。目前，對(duì)于不同比色法所適用的細(xì)胞初始接種密度，尚未見(jiàn)相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行嚴(yán)格限定。而本研究結(jié)果也證明細(xì)胞初始接種密度確實(shí)是影響細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果的重要因素之一，且不同的細(xì)胞毒性試驗(yàn)其最適初始接種密度有所不同，并通過(guò)試驗(yàn)得到了CHO細(xì)胞進(jìn)行中性紅比色法和MTT比色法細(xì)胞毒性試驗(yàn)的最適細(xì)胞初始接種密度的范圍，在具體試驗(yàn)操作中應(yīng)根據(jù)試驗(yàn)需求選取最適濃度，以提高試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性及可比性。

3 結(jié)論

綜合CHO細(xì)胞倍增試驗(yàn)與CHO細(xì)胞不同初始接種密度對(duì)中性紅比色法和MTT比色法兩個(gè)細(xì)胞毒性試驗(yàn)影響的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)：以2×104～6×104個(gè)·mL-1為初始接種密度，細(xì)胞在48 h內(nèi)生長(zhǎng)速度較為穩(wěn)定；以4×104～6×104個(gè)·mL-1的初始密度接種細(xì)胞，中性紅比色法細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果較為穩(wěn)定，可重復(fù)性較好；而以2×104～4×104個(gè)·mL-1的初始密度接種細(xì)胞，MTT比色法細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果較穩(wěn)定。

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