劉付寧，紀風濤，何惠燕，梁建軍，劉 玲，曹銘輝△

(中山大學孫逸仙紀念醫(yī)院 1麻醉科，2供應中心，廣東 廣州 510120)

腦血管病是當今影響人類健康及致死、致殘的主要疾病之一，其中以缺血性腦血管病最為常見。對缺血腦組織進行及時再灌注是治療腦卒中的有效措施，但再灌注會引起腦缺血再灌注損傷。腦缺血再灌注損傷時，神經元與膠質細胞、膠質細胞與膠質細胞之間的相互作用對神經元的存活具有重要作用。星形膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)內數(shù)量最多的一類細胞，也是中樞神經系統(tǒng)微環(huán)境的主要構成成分，對維持神經元微環(huán)境的穩(wěn)定和調節(jié)代謝過程起重要作用［1-2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞在腦缺血后非?；钴S，主要表現(xiàn)為膠質細胞增生、肥大，膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)表達水平升高，并且合成多種炎癥因子，介導炎癥反應從而導致大腦神經組織損傷［3］。在星形膠質細胞誘導產生的多種炎癥因子中，腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α，TNF-α)是炎癥反應的主要致炎因子，在細胞因子的釋放順序中處于源頭，參與了腦缺血后炎癥與細胞死亡的過程［4］。

鹽酸右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是一種新型高選擇性的α2-腎上腺素受體激動劑，于2009年6月在我國上市。它除了具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗焦慮作用，還具有抗交感、抑制應激反應、穩(wěn)定血流動力學和減少麻醉藥用量作用等，目前已廣泛應用于臨床各個領域。最近研究發(fā)現(xiàn)DEX具有腦保護作用，但具體作用機制目前研究很少。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)DEX對膠質細胞具有調控作用［5］，但是DEX能否通過調控膠質細胞達到腦保護作用目前還不清楚。本實驗擬在建立局灶腦缺血/再灌注模型，通過觀察DEX對星形膠質細胞的影響，探討DEX在腦保護中的作用機制。

材料和方法

1 材料

SPF級SD大鼠，雌性，體重220～250 g，由中山大學實驗動物中心提供;DEX購自恒瑞制藥，GFAP單克隆抗體購自Neomarkers;TNF-α多克隆抗體購自武漢博士德生物技術有限公司;β-actin單克隆抗體購自Sigma;HRP標記山羊抗鼠IgGⅡ抗購自Amersham。TBST配制抗體稀釋液和Western blotting化學發(fā)光檢測試劑盒購自碧云天生物技術公司。

2 動物選擇和分組

健康雌性SD大鼠60只，隨機分為假手術組(sham 組)、缺血/再灌注組(ischemia/reperfusion，I/R組)、DEX1組(缺血前30 min腹腔給予DEX 20 μg/kg)和DEX2組(缺血前30 min腹腔給予DEX 40 μg/kg)。

3 動物模型制作

SD大鼠術前禁食12 h，自由飲水，動物模型制作參考Longa等［6］的制作方法制作大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)缺血再灌注模型。實驗前腹腔注射10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉后，分離出右側頸外動脈，以尼龍線栓塞右側大腦中動脈，栓線深度18～20 mm，阻斷2 h后再灌注，縫合皮下組織和皮膚，完成腦缺血/再灌注模型。大鼠清醒后進行神經功能缺失評分:無明顯神經功能缺失為0分;左側前爪不能伸直為1分;行走時向左側旋轉為2分;行走時身體向左側傾倒者為3分;不能自發(fā)行走，意識喪失者為4分。

4 給藥

DEX1組和DEX2組給藥如前所述;I/R組給予等量的生理鹽水，sham組只作切口和動脈分離手術，但不行腦缺血再灌注。

5 HE染色

大鼠在缺血24 h后，以10%水合氯醛腹腔注射將其麻醉，開胸經心臟灌流生理鹽水，然后輸注4%多聚甲醛灌流固定，斷頭取腦。甲醛固定，冠狀腦片制備，選擇梗死最大層面，梯度乙醇脫水，石蠟包埋，制成4～6 mm厚的切片，附片，行蘇木素-伊紅染色。在4倍鏡下觀測缺血區(qū)面積，經圖像分析軟件統(tǒng)計處理得出各組的平均缺血面積。

6 免疫組織學觀察

各組SD大鼠腦缺血再灌注24 h后斷頭取腦，將腦組織迅速置-80℃冷凍并保存。-20℃恒冷切片機于自額極至枕葉分為5等份，取第3片腦片范圍內連續(xù)切片(厚4 μm)，冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定10 min，3%H2O2室溫10 min;0.01 mmol/L PBS浸泡 3次，5 min/次，0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH 6.0)中微波修復10 min，自然冷卻至室溫。正常山羊血清液封閉10 min，滴加抗小鼠GFAP單克隆或TNF-α多克隆抗體，4℃過夜;滴加生物素標記抗小鼠Ⅱ抗，37℃孵育20 min;滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉素卵白素，37℃孵育20 min;DAB顯色，蘇木精復染，封片。常規(guī)設立陰性對照，以缺血病灶為觀察部位，400倍光鏡下隨機選擇不重疊10個海馬區(qū)視野，以胞漿和突起呈棕黃色的細胞為GFAP陽性表達細胞，以胞漿、胞膜呈棕黃色的細胞為TNF-α陽性表達細胞，每組5只大鼠，每只大鼠隨機選取5張非連續(xù)切片，計算每只大鼠平均陽性細胞數(shù)。

7 蛋白印跡技術檢測大鼠大腦皮質的GFAP表達的變化

大鼠斷頭處死后迅速取出右側大腦組織，用預冷PBS液沖去表面血跡，置冰盤上快速分離右側頂葉皮質，取大鼠大腦組織1 mg加入10 mL體積的比例加入蛋白裂解液，冰上裂解、勻漿，5000 r/min離心15 min，提取總蛋白，BCA法測蛋白濃度。經10%SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、封閉后，加入Ⅰ抗孵育過夜。加入標記辣根過氧化物酶的抗鼠/兔的IgGⅡ抗，室溫下孵育1 h，ECL顯色，掃描后用Image J軟件分析系統(tǒng)定量，計算灰度值，以β-actin灰度值進行校正，再以sham組為100%進行校正，實驗重復3次。

8 統(tǒng)計學處理

結 果

1 神經功能行為評分

缺血/再灌注后各組大鼠均出現(xiàn)了不同程度神經功能損害癥狀，神經功能缺損評分均高于sham組，與I/R組比較，DEX1組和DEX2組神經功能缺失評分明顯降低，見表1。

表1 DEX對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能缺失評分和梗死面積的影響Table 1.Effects of DEX on neurological deficiency scores and infarct size in rats with ischemia/reperfusion(.n=6)

表1 DEX對大鼠腦缺血再灌注損傷后神經功能缺失評分和梗死面積的影響Table 1.Effects of DEX on neurological deficiency scores and infarct size in rats with ischemia/reperfusion(.n=6)

★P＜0.05 vs sham;△P＜0.05 vs I/R;#P＜0.05 vs DEX1.

Sham 0 0 I/R 3.89±0.45★ 1.70±0.31★DEX1 2.13±0.38★△ 1.21±0.23★△DEX2 2.03±0.51★△ 1.06±0.07★△#

2 HE染色

光鏡下見sham組大鼠腦組織細胞排列有序，細胞形態(tài)和結構正常，神經元核圓形，邊界及核仁清晰，胞漿染色均勻淡染，胞膜完整;I/R組大鼠腦組織有缺血性損傷改變，缺血區(qū)擴展到整個大腦中動脈供應區(qū)，其腦組織著色淺，細胞染色淡，數(shù)量明顯減少，與正常腦組織有過渡區(qū)，細胞數(shù)量減少，部分細胞胞體縮小，胞核固縮，染色質濃縮，缺血邊緣區(qū)也表現(xiàn)為水腫;DEX1組和DEX2組也可見缺血性損傷改變，但面積較I/R組相應減小，細胞水腫較輕，變性壞死數(shù)量較少。與DEX1組比較，DEX2組腦梗死面積減小，見圖1、表1。

Figure 1.The pathological changes of the brain in rats after 2 h of MCAO followed by 24 h of reperfusion in various groups(HE staining，×400).A:sham;B:I/R;C:DEX1;D:DEX2.圖1 各組大鼠大腦組織HE染色

3 免疫組織學改變

3.1 免疫組織學檢測GFAP表達變化 在sham組大腦，星形膠質細胞GFAP表達較少，細胞淡染，胞體小，突起細少，纖維排列呈放射狀，GFAP陽性星形膠質細胞少;I/R組星形膠質細胞GFAP表達明顯增多，染色呈深棕黃色，胞體肥大，突起粗大不規(guī)則，GFAP陽性星形膠質細胞明顯增多，呈強陽性;而DEX1組和DEX2組星形膠質細胞GFAP表達多于sham組，但比I/R組減少，胞體形態(tài)趨于正常，GFAP陽性星形膠質細胞也相應減少，見圖2。

3.2 各組大鼠GFAP陽性細胞計數(shù) 腦缺血再灌注后I/R組腦組織內有較多細胞表達GFAP，腦缺血后GFAP陽性細胞數(shù)較sham組顯著增多(P＜0.05)，DEX預處理后GFAP陽性細胞數(shù)均較I/R組顯著減少(P＜0.05)，且DEX2組比DEX1組減少更顯著(P ＜0.05)，見表2。

3.3 免疫組織學檢測TNF-α表達變化 Sham組大鼠腦組織偶然可以看到零散分布的TNF-α陽性細胞，均為神經元樣細胞。I/R組梗死區(qū)TNF-α陽性神經元樣細胞增多，同時TNF-α陽性星形膠質細胞增多，呈強陽性。而DEX預處理組TNF-α陽性星形膠質細胞多于sham組，但比I/R組減少，見圖3。

3.4 各組大鼠TNF-α陽性細胞計數(shù) 與sham組比較，腦缺血再灌注后I/R組TNF-α陽性細胞數(shù)顯著增多(P＜0.05)，而DEX預處理后TNF-α陽性細胞數(shù)均較 I/R組顯著減少(P＜0.05)，并且DEX2組比DEX1組減少更顯著(P＜0.05)，見表2。

Figure 2.Effects of DEX on GFAP-labeled cells in ischemic area of brain in rats after 2 h of MCAO followed by 24 h of reperfusion in various groups(DAB，×400).A:sham;B:I/R;C:DEX1;D:DEX2.圖2 DEX對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側大腦GFAP表達的影響

Figure 3.Effects of DEX on TNF-α-labeled cells in ischemic area of brain in rats after 2 h of MCAO followed by 24 h of reperfusion in various groups(DAB，×400).A:sham;B:I/R;C:DEX1;D:DEX2.圖3 DEX對大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血側大腦TNF－α表達的影響

表2 星形膠質細胞表達GFAP和TNF－α蛋白的計數(shù)Table 2.Counting of astrocytes expressing TNF-α and GFAP proteins in rats(.n=6)

表2 星形膠質細胞表達GFAP和TNF－α蛋白的計數(shù)Table 2.Counting of astrocytes expressing TNF-α and GFAP proteins in rats(.n=6)

★P＜0.05 vs sham;△P＜0.05 vs I/R;#P＜0.05 vs DEX1.

Group GFAP TNF-α Sham 13.39±1.40 1.06±0.09 I/R 34.84±3.45★ 7.10±2.51★DEX1 23.26±2.57★△ 3.48±0.47★△DEX2 19.71±4.52★△# 3.06±0.64★△#

4 Western blotting檢測DEX預處理對GFAP表達的影響

GFAP蛋白表達水平在缺血再灌注組24 h后明顯升高，DEX預處理后，GFAP表達水平比缺血再灌注組顯著降低，且以DEX2組效果更加明顯。

Figure 4.Effects of DEX on the expression of GFAP in rats..n=6.*P ＜0.05 vs sham;△P ＜0.05 vs I/R;#P ＜0.05 vs DEX1.圖4 DEX對大鼠腦缺血再灌注后缺血側大腦皮層GFAP表達的影響

討 論

腦血管病變是臨床多發(fā)病、常見病。近年來，其發(fā)病率、致死率和致殘率有上升趨勢，成為目前臨床上致殘、致死的主要原因，其中又以缺血性腦血管病變最為常見。缺血性腦血管病變特別是腦缺血后的再灌注損傷，危害大，其相關機制的研究一直是臨床和基礎研究的焦點。目前，對于腦缺血/再灌注損傷機制的研究主要集中在興奮性神經毒性、氧化損傷、炎癥反應、Ca2+超負荷等方面，其中，缺血再灌注時的炎癥反應是腦缺血/再灌注損傷的主要機制之一［7］。近年來研究發(fā)現(xiàn)星形膠質細胞在腦缺血后非?；钴S，主要表現(xiàn)為膠質細胞增生、肥大，GFAP表達水平升高，并且合成多種炎癥因子，介導炎癥反應從而導致大腦神經組織損傷［1-2］。因此，我們采用DEX作為干預手段，通過觀察其對缺血再灌注損傷后星形膠質細胞的影響，探討其對缺血再灌注損傷保護的可能機制。GFAP是一種中間絲蛋白，作為星形膠質細胞的細胞骨架，同時它也是星形膠質細胞中的一種標志蛋白，參與維持神經元內環(huán)境的穩(wěn)定和血腦屏障的功能。在星形膠質細胞激活后除了膠質細胞胞體的增生、肥大，同時也出現(xiàn)星形膠質細胞膠質纖維酸性蛋白表達增強的現(xiàn)象，并且其表達水平與星形膠質細胞激活程度密切相關［8-10］。我們的實驗發(fā)現(xiàn)缺血再灌注24 h后，星形膠質細胞GFAP表達量增加，這與Rom?o等［11］的研究結果一致。

DEX是一種新型高選擇性α2-腎上腺素受體激動劑，在我國上市后，由于它除了具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜和抗焦慮作用，還具有抗交感、抑制應激反應、穩(wěn)定血流動力學和減少麻醉藥用量等多方面作用，目前已廣泛應用于臨床各個領域。DEX主要藥理作用主要是通過激活腦干藍斑去甲腎上腺素能神經元α2受體后，產生鎮(zhèn)靜作用;并抑制下行延髓-脊髓去甲腎上腺素能通路突觸前膜P物質和其它傷害性肽類的釋放，產生鎮(zhèn)痛作用［12-13］。這說明 DEX對神經元興奮性具有抑制作用。但DEX對星形膠質細胞影響的研究很少，特別是DEX對缺血再灌注后星形膠質細胞的影響未見報道。實驗中我們發(fā)現(xiàn)DEX 20 μg/kg或 DEX 40 μg/kg明顯抑制了缺血再灌注誘導的星形膠質細胞GFAP和TNF-α的表達增加，并且以DEX 40 μg/kg效果更加明顯，提示DEX可能對缺血再灌注誘導的星形膠質細胞激活有直接抑制作用。一方面有研究發(fā)現(xiàn)α2受體不但分布于中樞去甲腎上腺素能神經元突觸前膜，中樞神經系統(tǒng)膠質細胞膜也有分布［14］;另一方面，Chen 等［15］研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)的星形膠質細胞加入DEX后細胞內CO2生成增加，氧化代謝增強，星形膠質細胞對細胞間隙谷氨酸的清除能力增加，細胞外谷氨酸含量減少，谷氨酸激活星形膠質細胞膜上N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)受體減少，星形膠質細胞激活減少。

近年來，星形膠質細胞激活和缺血再灌注損傷的關系越來越受到人們的關注。一方面，腦缺血后星形膠質細胞激活，其對細胞間隙的谷氨酸及H+、K+等清除能力增加，釋放神經營養(yǎng)因子增多，有助于腦缺血后受損神經元的修復;另一方面，星形膠質細胞的過度激活影響受損神經元修復和功能恢復，同時通過釋放谷氨酸造成興奮性氨基酸毒性、釋放炎癥因子等，加重神經元的損傷。目前，星形膠質細胞在腦缺血再灌注過程中發(fā)揮保護或損傷作用的時間及深入機制尚未明確，還有待進一步研究。本實驗發(fā)現(xiàn)DEX對大腦缺血再灌注損傷具有保護作用，其作用機制可能與抑制星形膠質細胞過度激活、減少星形膠質細胞釋放TNF-α等炎癥因子有關。

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