李 熙 孫國(guó)杰 王述菊 馬 駿 王彥春 張春麗 (湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北 武漢 430061)

阿爾茨海默病(AD)治療方法僅能緩解癥狀，不能改變疾病病程〔1〕，且治療和護(hù)理費(fèi)用昂貴。找尋防治AD的有效方法迫在眉睫，對(duì)AD研究的側(cè)重點(diǎn)也開(kāi)始轉(zhuǎn)向早期診斷和早期干預(yù)〔2〕。本研究觀察艾灸預(yù)處理對(duì)AD模型大鼠海馬區(qū)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)及其受體酪氨酸激酶(Trk)B含量的影響，探討艾灸防治AD的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 健康雄性SD大鼠(15月齡)50只，體重350～480 g，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(許可證號(hào):SCXK(鄂)2004－0007)。所有大鼠提前1 w運(yùn)到實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性喂養(yǎng)，安靜清潔環(huán)境下正常飲食飲水。然后進(jìn)行Y型水迷宮篩選，淘汰反應(yīng)過(guò)于遲鈍或特別敏感的大鼠，將合格大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，正常組、假手術(shù)組、模型組、預(yù)艾灸組，每組10只。

1.2 主要試劑及儀器 Aβ25～35(美國(guó) Sigma公司)，兔抗鼠BDNF多克隆一抗(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗鼠TrkB多克隆一抗(武漢博士德生物工程有限公司)，免疫組化SP－9001試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，DW－5腦立體定位儀(成都泰盟科技有限公司)，臺(tái)式牙鉆機(jī)(成都康發(fā)醫(yī)療器械有限公司);ES－2100S電子天平(長(zhǎng)沙湘平科技發(fā)展有限公司)，Sartorius分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leitz公司)，PHY－Ⅲ病理組織漂洪處理儀(常州中威電子儀器廠(chǎng))，BMJ－Ⅲ型病理組織包埋冷凍臺(tái)(常州中威電子儀器廠(chǎng))，BX50光學(xué)顯微鏡(日本OLMPUS公司)，HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)(同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)千屏影像公司)。

1.3 AD模型制作

1.3.1 Aβ25～35孵育 用無(wú)菌生理鹽水將 Aβ25～35稀釋成5 μg/μl，密封后置于37℃培養(yǎng)箱中孵育1 w，使其變?yōu)榫奂癄顟B(tài)的 Aβ25～35。

1.3.2 造模方法 在腦立體定位儀下，大鼠雙側(cè)海馬一次性注射聚集態(tài)Aβ25～35制作AD模型〔3〕。大鼠給予10%水合氯醛(35 mg/100 g體重)腹腔注射麻醉后，將鼠頭固定于腦立體定位儀上保持前后囟在同一水平，剪開(kāi)頭皮，暴露前囟，定位海馬區(qū)〔4〕(前囟后3.5 mm，中線(xiàn)旁開(kāi)2.0 mm，硬腦膜下2.7 mm)，臺(tái)式牙鉆機(jī)鉆一小孔 (直徑1 mm)，垂直插入微量進(jìn)樣器，將Aβ25～35聚集液緩慢注入，左右側(cè)各注射1 μl(5 μg/μl)，注射速度 0.2 μl/min，注射完畢后留針 5 min，使Aβ25～35充分浸潤(rùn)局部組織，按1.0 mm/min速度緩慢拔針。完成后馬上縫合頭皮，術(shù)后每天肌肉注射青霉素10萬(wàn)U/只，連續(xù)5 d。

1.4 各組處理方法 ①預(yù)艾灸組，對(duì)正常大鼠先施于艾灸刺激。艾灸方法:采用自制的直徑約8 mm艾條，參照華興邦等制定的《大鼠穴位圖譜的研制》〔5〕，于正常大鼠“百會(huì)”(頂骨正中)、“腎俞”(第2腰椎下兩旁)、“足三里”(膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，腓骨小頭下約5 mm處)穴上方2～3 cm處懸灸(“腎俞”、“足三里”左右隔日交替使用)，每穴持續(xù)5 min，每日1次，6 d為1療程，療程間休息1 d，共3個(gè)療程。施灸結(jié)束當(dāng)日即開(kāi)始給大鼠雙側(cè)海馬區(qū)注射Aβ25～35建立AD模型，造模后次日繼續(xù)艾灸治療1療程。②模型組:正常喂養(yǎng)3 w后，按前述方法造模。造模后喂養(yǎng)1 w，檢測(cè)指標(biāo)。③假手術(shù)組:雙側(cè)海馬區(qū)注射等量生理鹽水，余同模型組。④正常組:同步喂養(yǎng)，不做任何處理。

1.5 組織取材及處理 用10%水合氯醛 (35 mg/100 g體重)腹腔注射麻醉大鼠，剖開(kāi)腹腔和胸腔，暴露心臟。用灌胃針從心尖部位插進(jìn)左心室，穿入主動(dòng)脈，然后將右心耳剪口以使血液和灌注液流出。先用生理鹽水快速灌注，沖洗至右心耳流出液體變?yōu)闊o(wú)色及內(nèi)臟顏色變成淺白，再用4%多聚甲醛灌注固定至動(dòng)物全身僵硬。斷頭快速取腦，在視交叉平面前后4 mm處將腦冠狀切開(kāi)，留取中間部分置于4%多聚甲醛磷酸緩沖液中固定過(guò)夜，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)切片，片厚4 μm。

1.6 指標(biāo)檢測(cè) 免疫組化SP法檢測(cè)BDNF、TrkB:石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水;高溫下EDTA液抗原修復(fù);3%過(guò)氧化氫液37℃下孵育10 min;蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min;正常山羊血清室溫下孵育10 min;一抗4℃孵育過(guò)夜;PBS沖洗，3 min×3次;生物素標(biāo)記的二抗37℃下孵育10 min;PBS沖洗，3 min×3次;辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液37℃下孵育10 min;PBS沖洗，3 min×3次;DAB顯色，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng);蘇木精復(fù)染，脫水，透明，封片。PBS代替一抗做陰性對(duì)照，其他步驟相同。

1.7 圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 OLMPUS BX50光學(xué)顯微鏡下觀察海馬CA1區(qū)并攝像。用HPIAS－1000高清晰度彩色病理圖文分析系統(tǒng)測(cè)定免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的平均灰度值，每組每張切片海馬CA1區(qū)隨機(jī)選取4個(gè)視野，取平均值。數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，運(yùn)用SPSS13.0軟件統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

免疫組化切片以細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)呈現(xiàn)棕黃色為陽(yáng)性。平均灰度值與免疫陽(yáng)性產(chǎn)物含量成反比，灰度值低，說(shuō)明透光度低，染色強(qiáng)度高。與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及TrkB的表達(dá)明顯下降，表現(xiàn)為陽(yáng)性神經(jīng)元平均灰度值明顯上升 (P＜0.01);與模型組比較，預(yù)艾灸組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及TrkB的表達(dá)明顯增加，表現(xiàn)為陽(yáng)性神經(jīng)元平均灰度值明顯降低 (P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及其受體TrkB陽(yáng)性神經(jīng)元平均灰度值(±s)

表1 各組大鼠海馬CA1區(qū)BDNF及其受體TrkB陽(yáng)性神經(jīng)元平均灰度值(±s)

與正常組及假手術(shù)組比較:1)P＜0.01;與模型組比較:2)P＜0.01

組別 n BDNF TrkB正常組10 133.01±17.21 125.83±16.12假手術(shù)組 10 135.68±15.13 128.74±18.35模型組 10 178.30±11.321) 167.25±12.861)預(yù)艾灸組 10 143.12±10.372) 136.32±10.542)

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，AD的病位在腦，其發(fā)病與五臟功能密切相關(guān)，其中與腎、肝、心、脾四臟關(guān)系最為密切。腎精虧虛為AD的基本病機(jī)，痰濁瘀血既是AD患者體內(nèi)的病理產(chǎn)物，又是AD的致病因素，其病理性質(zhì)為本虛標(biāo)實(shí)。腎精虛衰，髓?？仗摓椴≈?。血瘀、痰濁內(nèi)阻，濁陰不降，上蒙清竅為病之標(biāo)〔7，8〕。依據(jù)AD“本虛標(biāo)實(shí)”的病理性質(zhì)及其病因，病機(jī)，病位和臨床癥狀等特點(diǎn)，我們制定了“益腎精、健脾胃、補(bǔ)腦髓”的治療法則，選取“百會(huì)”、“腎俞”、“足三里”穴艾灸進(jìn)行防治。百會(huì)位居頭之巔頂，又名三陽(yáng)五會(huì)，是督脈與足太陽(yáng)、手少陽(yáng)、足少陽(yáng)、足厥陰等經(jīng)脈交會(huì)處，是治療腦病的首選穴位，具有通調(diào)督脈氣血，補(bǔ)腦益智之功。腎俞位于背部，是膀胱經(jīng)之腧穴、腎之背俞穴，可補(bǔ)益腎精，且其所屬經(jīng)脈“入絡(luò)腦”。足三里是足陽(yáng)明胃經(jīng)的合穴，胃腑下合穴，可調(diào)理脾胃，助脾胃運(yùn)化水濕，蠲化痰濁;又可補(bǔ)益氣血，填精益髓，使髓海充足，神清竅利。百會(huì)、腎俞、足三里三穴同用，可使腦髓得氣血榮養(yǎng)而改善健忘、癡呆之癥。

BDNF是NTFs家族重要的成員之一，廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，能調(diào)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)生、發(fā)育和存活，維持成熟神經(jīng)元的功能〔8〕，在改善認(rèn)知功能方面也起著重要作用〔9〕。酪氨酸激酶(Trk)A，TrkB和TrkC是NTFs的受體，其中，TrkB為BDNF的特異性受體〔10〕，具有酪氨酸激酶活性。BDNF與TrkB結(jié)合可調(diào)節(jié)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)信號(hào)。研究發(fā)現(xiàn)，BDNF的表達(dá)與學(xué)習(xí)和記憶過(guò)程關(guān)系密切。動(dòng)物經(jīng)水迷宮學(xué)習(xí)訓(xùn)練后，腦內(nèi)BDNF mRNA表達(dá)增加〔11〕，而B(niǎo)DNF缺乏的動(dòng)物空間學(xué)習(xí)和記憶則出現(xiàn)明顯障礙〔12〕。

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