李寶善 王艷嬌 馬厚勛 吳 平 (重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院老年病科，重慶 400016)

Klotho基因最先由Kuro－o等〔1〕從衰老表現(xiàn)的模型小鼠中成功克隆，并發(fā)現(xiàn)該基因表達缺陷的小鼠會出現(xiàn)類似人衰老的一系列表型變化，如動脈硬化和異位鈣化、糖和能量代謝異常、生殖器官萎縮、骨質(zhì)疏松、肺氣腫等。目前，對Klotho在人、鼠的體內(nèi)分布及作用機制已有了一些認識。國外研究認為Klotho蛋白主要在腎臟遠曲小管和大腦脈絡(luò)叢表達〔2～4〕。也有報道在內(nèi)耳的血管紋和螺旋韌帶、肝臟、卵巢有表達。但是對于大鼠體內(nèi) Klotho分布的研究較少。為此，本研究根據(jù)Genebank中Klotho mRNA序列設(shè)計大鼠特異性引物，應用RTPCR方法結(jié)合ELISA法研究Klotho基因在大鼠體內(nèi)的分布以及年齡對其基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 5周齡SPF級SD小鼠12只購自重慶醫(yī)科大學實驗動物中心。RNAiso Plus、PrimeScript?RT reagent Kit、Premix Taq?Version2.0(Loading dye mix)、DL1000 DNA Marker為TakaRa公司產(chǎn)品。PCR引物由上海英駿公司合成。蛋白裂解液、PMSF、BCA法蛋白濃度測定試劑盒均為碧云天公司產(chǎn)品。ELISA試劑盒來自R＆D公司分裝。

1.2 主要儀器 Nano Drop2000微量分光光度計(Thermo)，s1000 PCR儀、DNA 電泳凝膠成像系統(tǒng)(Bio－Rad)，SpectraMax M2e酶標儀(Molecular Devices)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠 隨機分成兩組:對照組和老年組各6只。大鼠標準飼料喂養(yǎng)。3 w后處死對照組，取心臟、主動脈、腎臟、腦、肺、肝、胰、脾、骨骼肌、脂肪組織。老年組繼續(xù)飼養(yǎng)15個月后處死留取上述部位組織樣本，于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 RT－PCR檢測Klotho mRNA表達水平

1.3.2.1 總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄 上述所取組織各取約100 mg按RNAiso Plus說明書提取總RNA，DEPC處理水充分溶解后Nano Drop 2000微量分光光度計測濃度。取上述總RNA 2 μg，應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按 20 μl體系，37℃ 20 min，85℃變性5 s進行逆轉(zhuǎn)錄。所得逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物－20℃保存。

1.3.2.2 引物設(shè)計與合成 應用Primer 5軟件，由Genebank檢索的大鼠Klotho mRNA序列(NCBI Reference Sequence:NM_031336.1)設(shè)計下列引物:上游序列為:5′CCCGAA TGTCTATCTGTGG 3′;下游序列為:5′CGAAGTAAGGTTATCTGAGGC 3′，擴增長度為 129 bp。選大鼠 actin(NCBI Reference Sequence:NM_031144.2)為內(nèi)參:上游序列:5′GAGGGAAATCGTGCGTGAC 3′; 下游序列為:5′GCATCGGAACCGCTCATT 3′，擴增長度為157 bp。上述引物由上海英駿公司合成。

1.3.2.3 PCR反應 PCR反應體系為25 μl:逆轉(zhuǎn)錄所得cDNA 2 μl，Premix Taq(2 × )12.5 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，DEPC 處理水補足 25μl。反應條件:94℃ 預變性 3 min，94℃變性 30 s，45℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，循環(huán) 30 次，72℃終末延伸5 min。PCR擴增完畢，取5 μl在2%瓊脂糖凝膠(用1×TAE配制)電泳。DNA電泳凝膠成像系統(tǒng)照相、分析。

1.3.2.4 Klotho mRNA相對表達量的計算 在Quantity One軟件中打開DNA凝膠電泳圖像，采集各Klotho基因片段條帶及內(nèi)參條帶灰度值，以Klotho基因片段條帶與內(nèi)參條帶的灰度值比值作為Klotho mRNA相對表達量。

1.3.3 Klotho蛋白表達檢測

1.3.3.1 總蛋白提取及測定 取約100 mg組織，剪碎，加含1%PMSF蛋白裂解液400 μl，冰上勻漿、裂解30 min。4℃離心5 min，取上清液，棄沉淀，－80℃保存。按BCA法測定蛋白濃度，取上一步提取的蛋白1 μl測蛋白濃度。然后將所有總蛋白標準化為 0.2 μg/μl，備用。

1.3.3.2 ELISA檢測Klotho蛋白水平 取標準化濃度的蛋白樣品10 μl(總蛋白量為2 μg)按ELISA試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2.1 總RNA的制備 用Nano Drop 2000微量分光光度計測得總RNA的濃度在2 μg/μl以上;以 A260/A280比值鑒定RNA純度，所提取總RNA A260/A280比值均在1.82～1.95，說明提取的RNA沒有受到蛋白和有機試劑污染，沒有明顯降解，可以滿足實驗要求。

2.2 大鼠Klotho基因 RT－PCR結(jié)果 如圖1所示，以各組織、器官總RNA為模板，RT－PCR擴增得到Klotho基因片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見清晰的約129 bp Klotho基因條帶，表明兩組大鼠心臟、主動脈、腎臟、腦、肺、肝、胰、脾、骨骼肌、脂肪組織中均有Klotho mRNA表達。

圖1 Klotho mRNA表達分布情況RT-PCR

2.3 大鼠Klotho mRNA表達及分布 如表1所示，在老年組大鼠各器官組織中，Klotho mRNA相對表達量依次為:胰腺＞腎臟＞腦＞主動脈＞脾＞心臟＞肺＞骨骼?。靖闻K＞脂肪，其中在胰腺和腎臟高表達(P＜0.001)，在腦、主動脈、脾臟中等度表達(P＜0.01)，在心臟、肺、骨骼肌、肝臟、脂肪低表達(P＜0.001)。在青年大鼠(即對照組)中，Klotho mRNA相對表達量則依次為:腎臟＞胰腺＞主動脈＞心臟＞腦＞肝臟＞脾臟＞肺＞骨骼肌＞脂肪，其中在腎、胰腺、主動脈、心臟高表達(P＜0.001)，腦、肝臟、脾臟呈中等度表達(P＜0.01)，肺、骨骼肌、脂肪中低表達。兩組比較后發(fā)現(xiàn)，Klotho mRNA在兩組大鼠腎臟和胰腺中均高表達，而在骨骼肌、脂肪中均低表達，腦和脾臟中中等表達;同時還發(fā)現(xiàn)在老年組大鼠其以下器官Klotho mRNA表達顯著低于對照組:心臟(P＜0.001)、主動脈(P＜0.001)、腎臟(P＜0.001)、腦(P＜0.05)、肺(P＜0.01)、肝(P＜0.001)。而胰腺、脾臟、骨骼肌、脂肪組織Klotho mRNA表達與對照組無明顯差異。在對老年組和對照組各器官、組織Klotho mRNA相對表達量比較發(fā)現(xiàn)，老年組Klotho mRNA表達量顯著低于對照組(P＜0.05)，見表1。

2.4 ELISA法檢測Klotho蛋白表達分析 取兩組各器官組織總蛋白做ELISA檢測后發(fā)現(xiàn)均有Klotho蛋白表達。如表2所示，在老年組大鼠器官組織中，Klotho蛋白含量依次為:腎臟＞胰腺＞主動脈＞心臟＞腦＞肺＞肝臟＞骨骼?。酒⑴K＞脂肪，其中在胰腺、腎臟Klotho蛋白呈高表達(P＜0.001)，在腦、肺、骨骼肌、中等度表達(P＜0.01)，而在肝臟、脾臟、脂肪呈低表達(P＜0.001)。在青年大鼠(即對照組)組中，Klotho蛋白量依次為:腎臟＞胰腺＞骨骼?。局鲃用}＞心臟＞腦＞肺＞肝臟＞脾臟＞脂肪，其中腎臟、胰腺、主動脈、心臟呈高表達(P＜0.001)，在腦、肺呈中等度表達(P＜0.01)，而在肝、脾、骨骼肌、脂肪呈低表達(P＜0.001)，差異均有統(tǒng)計學意義。兩組比較發(fā)現(xiàn)，Klotho蛋白在兩組大鼠腎臟和胰腺中均高表達，而在肝、脾、脂肪均低表達;同時還發(fā)現(xiàn)老年組大鼠下述各器官Klotho蛋白表達顯著低于對照組:心臟(P＜0.001)、主動脈(P＜0.001)、腎臟(P＜0.001)、腦(P＜0.05)、肺(P＜0.01)、肝(P ＜0.001)、胰(P＜0.001)、脾(P＜0.05)、脂肪(P＜0.01)，差異均有統(tǒng)計學意義。在對老年組和對照組各器官、組織Klotho蛋白量比較發(fā)現(xiàn)，老年組Klotho蛋白量也顯著低于對照組(P＜0.001)，差異均有統(tǒng)計學意義。

表1 各組織Klotho mRNA相對表達量

表2 各組織Klotho蛋白表達分布(pg/ml)

3 討論

Klotho基因通過不同選擇性拼接產(chǎn)生兩種蛋白產(chǎn)物(Klotho):一種為膜型Klotho蛋白，屬于一種單次跨膜蛋白;另一種為分泌型Klotho蛋白。研究發(fā)現(xiàn)膜型klotho具有調(diào)節(jié)離子通道活性〔5〕;分泌型klotho作為一種循環(huán)因子或激素，抑制細胞內(nèi)胰島素/胰島素樣生長因子－1(insulin/IGF－1)信號級聯(lián)放大效應〔6〕，可抑制胰島素/IGF－1 信號通路〔7〕;還可以抑制氧化應激以及Wnt信號轉(zhuǎn)導〔8〕，并具有調(diào)節(jié)一氧化氮合成的作用。Klotho的作用涉及多個系統(tǒng)、器官、組織，通過多種途徑、機制發(fā)揮其生理作用。本實驗證實在大鼠心臟、主動脈、腎臟、腦、肺、肝、胰、脾、骨骼肌、脂肪組織中均有Klotho mRNA和蛋白表達;在腎臟和胰腺中高表達，在骨骼肌和脂肪組織低表達;并且從整體水平上研究發(fā)現(xiàn)老年大鼠中Klotho mRNA和蛋白表達明顯低于青年對照組，從而揭示klotho基因表達的組織分布特征及其與年齡相關(guān)的變化規(guī)律。本研究通過RT－PCR法結(jié)合ELISA法確認了Klotho基因在大鼠體內(nèi)各組織器官的分布情況，為進一步研究Klotho的生理學功能提供了實驗依據(jù)。

1 Kuro－o M，Matsumura Y，Aizawa H，et al.Mutation of the mouse klotho gene leads to a syndrome resembling ageing〔J〕.Nature，1997;390(6655):45－51.

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7 Kurosu H.Suppression of aging in mice by the hormone Klotho〔J〕.Science，2005;309(5742):1829－33.

8 Liu H，F(xiàn)ergusson MM，Castilho RM，et al.Augmented Wnt signaling in a mammalian model of accelerated aging〔J〕.Science，2007;317(5839):803－6.