胡婧，劉松青（第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院藥學(xué)部，重慶400038）

羥基喜樹堿（Hydroxycamptothecin，HCPT）是從我國特有的珙桐科植物喜樹中提取并研制開發(fā)的抗癌藥物，是細(xì)胞周期特異性藥物，通過抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ的活性來達(dá)到治療惡性腫瘤的目的。腦膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，由于其呈浸潤性生長，手術(shù)不易完全切除，且大多的化療藥物不易通過血腦屏障而難以在腦內(nèi)達(dá)到有效的治療濃度，術(shù)后易復(fù)發(fā)。如今，以生物可降解材料為載體的緩釋制劑的間質(zhì)內(nèi)化療的發(fā)展，大大提高了腦瘤患者的生存率[1]。在前期研究中，我院藥劑科實(shí)驗(yàn)室采用正交設(shè)計(jì)方法制備了HCPT緩釋片[2]，并對其自身的穩(wěn)定性和體外釋放情況進(jìn)行了一系列的考察，在此基礎(chǔ)上筆者擬對HCPT緩釋片進(jìn)行體內(nèi)研究評價(jià)，即考察緩釋片在大鼠腦內(nèi)的釋放情況，從而為HCPT緩釋片的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Alliance2690高效液相色譜系統(tǒng)，包括474熒光檢測器和Millennium色譜工作站（美國Waters公司）；Milli-Q型超純水器（美國Millipore公司）；BP211D型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 試藥

HCPT緩釋片（自制，批號：20090613，規(guī)格：每片2.4 mg）；HCPT對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：200301，純度：99.8%）；鹽酸氯胺酮注射液（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，批號：070302，規(guī)格：每支5 mL）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SD大鼠，體重200～250 g，♀♂各半，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號：SCXK（渝）2007-007。

2 HCPT體內(nèi)測定方法的建立

2.1 樣品處理方法

2.1.1 血漿樣品的處理。精密吸取100 μL血漿樣品，置于1.5 mL離心管中，加入10 μL冰醋酸振蕩混勻，避光放置2 h，再加入200 μL甲醇-乙腈（1∶3）混合液，振蕩20 s，13 000 r·min－1離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

2.1.2 組織樣品的處理。取出腦后，生理鹽水洗去殘血，濾紙吸干并稱重。以5 mL·g－1的比例，加入生理鹽水，勻漿。13 000 r·min－1離心5 min，取上清液即為腦組織液，備用。精密吸取腦組織液100 μL，置于1.5 mL離心管中，加入10 μL冰醋酸振蕩混勻，避光放置2 h，再加入200 μL甲醇-乙腈（1∶3）混合液，振蕩20 s，13 000 r·min－1離心5 min，取上清液進(jìn)樣。

2.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%三乙胺溶液（磷酸調(diào)pH至3.0）＝25∶75（V/V），流速：1.0 mL·min－1；柱溫：30 ℃；激發(fā)波長：363 nm；發(fā)射波長：550 nm；進(jìn)樣量：10 μL。取HCPT對照品、空白血漿、血漿樣品、空白腦組織、腦組織樣品進(jìn)樣分析，記錄色譜。結(jié)果表明，HCPT保留時(shí)間約為6.60 min，空白血漿和空白腦組織中其他成分不影響HCPT的測定。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.空白血漿；C.血漿樣品；D.空白腦組織；E.腦組織樣品；1.HCPTFig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.blank plasma；C.plasma sample；D.blank cerebral tissue；E.cerebral tissue sample；1.HCPT

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.3.1 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取HCPT對照品1 mg，用甲醇溶液定容至100 mL容量瓶中，制備成濃度為10 μg·mL－1的貯備液，將貯備液用空白血漿稀釋成濃度為1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.625 ng·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定，記錄色譜。以血漿藥物濃度（X）對峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝2.49×102X+7.52×102（r＝0.999 7）。結(jié)果表明，血漿HCPT檢測濃度在15.625～1 000 ng·mL－1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.3.2 腦組織標(biāo)準(zhǔn)曲線。取“2.3.1”項(xiàng)下貯備液，用空白腦組織液稀釋成濃度為 5 000、2 500、1 250、625、312.5、156.25、78.125、39.062 5 ng·mL－1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定，記錄色譜。以腦組織藥物濃度（X）對峰面積（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為Y＝2.50×102X－1.54×102（r＝0.998 1）。結(jié)果表明，腦組織HCPT檢測濃度在39.062 5～5 000 ng·mL－1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。

2.4 回收率試驗(yàn)

2.4.1 血漿樣品。按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備含HCPT 31.25、125、500 ng·mL－1的血漿樣品，照“2.1.1”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定，記錄色譜，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.4.2 腦組織樣品。按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備含HCPT 156.25、625、2 500 ng·mL－1的腦組織樣品，照“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定，記錄色譜，并計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表1 血漿樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 1Results of recovery test in plasma sample（n＝5）

表2 腦組織樣品回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）Tab 2Results of recovery test in cerebral tissue sample（n＝5）

2.5 精密度試驗(yàn)

2.5.1 血漿樣品。按“2.3.1”項(xiàng)下方法制備含HCPT 31.25、125、500 ng·mL－1的血漿樣品，照“2.1.1”項(xiàng)下方法處理。同日內(nèi)進(jìn)樣測定5次；另每日測定1次，連續(xù)測5 d，計(jì)算日內(nèi)和日間RSD。結(jié)果，血漿樣品的日內(nèi)RSD為0.7%～2.0%，日間RSD為2.0%～4.4%。

2.5.2 腦組織樣品。按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備含HCPT 156.25、625、2 500 ng·mL－1的腦組織樣品，照“2.1.2”項(xiàng)下方法處理。同日內(nèi)進(jìn)樣測定5次；另每日測定1次，連續(xù)測5 d，計(jì)算日內(nèi)和日間RSD。結(jié)果，腦組織樣品的日內(nèi)RSD為0.2%～0.4%，日間RSD為2.0%～5.0%。

3 HCPT緩釋片大鼠腦內(nèi)釋放度的考察

3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將HCPT緩釋片通過10 kGy的60Co照射消毒，檢測經(jīng)照射后23 d內(nèi)緩釋片性狀、含量、累積釋放率有無變化。結(jié)果表明，HCPT緩釋片經(jīng)60Co照射消毒后性狀、含量、累積釋放率均無明顯變化，具體結(jié)果見表3。

表3 HCPT緩釋片經(jīng)60Co照射后的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 Results of stability tests of HCPT sustained-release tablets after exposure to60C（o±s，n＝3）

表3 HCPT緩釋片經(jīng)60Co照射后的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（±s，n＝3）Tab 3 Results of stability tests of HCPT sustained-release tablets after exposure to60C（o±s，n＝3）

累積釋放率/%23 d 73.67±2.3 74.16±3.1時(shí)間照射前照射后性狀光滑、黃色光滑、黃色含量/%100.43 100.31 3 d 30.37±3.1 31.53±2.7 7 d 42.12±2.9 41.59±3.3 17 d 60.75±3.7 62.08±2.6

3.2 給藥方法

取大鼠40只，腹腔給予鹽酸賽拉嗪注射液麻醉后，將大鼠頭部固定，酒精消毒，于矢狀縫右2 mm、冠狀縫后3 mm處切開皮膚，鉆孔，孔徑約3.5 mm，將1片HCPT緩釋片植入額葉腦皮質(zhì)下1 mm處，骨蠟封閉骨孔，縫合皮膚[3～5]。

3.3 樣品的采集

將植入前的HCPT緩釋片中HCPT的含量質(zhì)量記為W1，于植入后第1、3、7、10、13、17、21、28天分別處死5只大鼠，完整地暴露大鼠的腦組織，將殘留于腦中的緩釋片取出置于表面皿中，研磨后加入甲醇-二氯甲烷（1∶1）適量溶解，過濾，將續(xù)濾液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中，并加入甲醇定容至刻度，13 000 r·min－1離心5 min，取上清液進(jìn)樣測定，測得的HCPT的量為殘留在大鼠腦組織中未釋放的藥量W2。在腦組織中釋放的藥量為W3＝W1－W2。結(jié)果，HCPT緩釋片在大鼠腦內(nèi)的累積釋放率見表4。

表4 HCPT緩釋片在大鼠腦內(nèi)的累積釋放率（±s，n＝5）Tab 4 Cumulative release rate of HCPT sustained-release tablets in cerebral tissue of rat（s±s，n＝5）

表4 HCPT緩釋片在大鼠腦內(nèi)的累積釋放率（±s，n＝5）Tab 4 Cumulative release rate of HCPT sustained-release tablets in cerebral tissue of rat（s±s，n＝5）

由表4可知，HCPT緩釋片在腦內(nèi)的釋放時(shí)間達(dá)到28 d以上，有較好的緩釋效果，且釋放較均勻、平穩(wěn)。

時(shí)間/d 累積釋放率/%0 12.13±7.58 28.23±9.81 36.34±8.22 42.96±12.74 50.39±8.56 60.77±17.48 67.51±14.75 72.31±15.17 01371 0 13 17 21 28

4 HCPT在腦組織和外周血漿中的濃度比較

4.1 HCPT在血漿中的濃度

在“3.3”項(xiàng)下時(shí)間點(diǎn)1、3、7、10、13、17、21、28 d處死大鼠之前，從尾靜脈采血0.5 mL，置于已加入肝素鈉的抗凝管中，4 000 r·min－1離心5 min，分離血漿，按“2.1.1”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定，記錄色譜，計(jì)算血漿中HCPT濃度。HCPT緩釋片在大鼠血漿中的藥物濃度見表5，藥-時(shí)曲線見圖2。

表5 HCPT緩釋片在大鼠血漿及腦組織中的藥物濃度（x±s，n＝5）Tab 5 Concentration of HCPT sustained-release tablets in plasma and cerebral tissue（±s，n＝5）

表5 HCPT緩釋片在大鼠血漿及腦組織中的藥物濃度（x±s，n＝5）Tab 5 Concentration of HCPT sustained-release tablets in plasma and cerebral tissue（±s，n＝5）

時(shí)間/d 1371 0 13 17 21 28 HCPT的濃度血漿/ng·mL－1 200.52±14.56 223.21±23.15 124.04±11.44 135.32±17.03 140.03±11.64 139.21±12.69 136.86±15.37 133.75±10.81腦組織/μg·mL－1 183.16±31.40 151.62±19.31 138.15±16.23 135.76±23.02 130.46±18.19 150.66±18.07 141.92±20.33 135.41±17.48

圖2 HCPT緩釋片在大鼠腦組織及血漿中的藥-時(shí)曲線Fig 2 The concentration-time curves of HCPT sustained-release tablets in cerebral tissue and plasma

4.2 HCPT在腦組織中的濃度

在“3.3”項(xiàng)下時(shí)間點(diǎn)1、3、7、10、13、17、21、28 d處死大鼠后，將取出殘留緩釋片后的腦組織用生理鹽水沖洗殘血，濾紙吸干后稱重，勻漿。按“2.1.2”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)樣測定，記錄色譜，計(jì)算腦組織中HCPT濃度。HCPT緩釋片在大鼠腦組織中的藥物濃度見表5，藥-時(shí)曲線見圖2。

由表5結(jié)果表明，HCPT在腦組織中的濃度遠(yuǎn)高于在血漿中的濃度，在8個(gè)時(shí)間點(diǎn)測得的HCPT在腦組織中的濃度均高于130 μg·mL－1，最高濃度達(dá)到183.16 μg·mL－1，遠(yuǎn)高于半數(shù)有效抑制率（IC50）為135 μg·mL－1時(shí)HCPT的濃度，因此，在緩釋過程中，腦組織中的HCPT濃度能長時(shí)間地保持在IC50以上[6]，對腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有很好的殺滅作用；而HCPT在血漿中的濃度均＜223.21 ng·mL－1，遠(yuǎn)低于在腦組織中的濃度，預(yù)示緩釋片可降低全身性毒副作用。

5 討論

本實(shí)驗(yàn)對HCPT緩釋片的體內(nèi)釋放進(jìn)行了考察，通過剩余藥量法測得HCPT緩釋片在大鼠腦內(nèi)的累積釋放率，其結(jié)果表明，緩釋片在大鼠腦內(nèi)具有較好的緩釋效果，在28 d內(nèi)，藥物從緩釋片中平穩(wěn)、緩慢地釋放，累積釋放率為72.31%，預(yù)示緩釋片在腦內(nèi)的釋放時(shí)間可達(dá)1個(gè)月以上；且藥物單日內(nèi)的累積釋放率達(dá)到12%，腦組織中濃度達(dá)（183.16±31.40）μg·mL－1，能夠達(dá)到首劑有效治療濃度。

腦內(nèi)植入緩釋片制備的主要目的是使藥物能夠在腦組織中達(dá)到有效治療濃度而在外周血中的濃度相對較低，以有效提高藥物的治療作用而減小藥物的全身性毒副作用。HCPT緩釋片植入大鼠腦內(nèi)后，比較在腦組織中以及外周血中HCPT的濃度，結(jié)果表明，HCPT在腦組織中的濃度遠(yuǎn)高于在外周血中的濃度，預(yù)示所制備的HCPT釋片能夠在大鼠腦內(nèi)維持有效治療高濃度，而在外周血漿中濃度較低，從而降低全身性毒副作用，達(dá)到腦內(nèi)植入緩釋片的設(shè)計(jì)目的。

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