吳 欣，蔣文勇，劉 倩，于 黔（貴陽市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科，貴陽 550002）

糖尿病腎?。―iabetic nephropathy，DN）作為糖尿病最主要的微血管慢性并發(fā)癥[1]，是導(dǎo)致終末期腎病最常見的原因，目前尚無有效的預(yù)防和干預(yù)手段。因此，致力于發(fā)現(xiàn)新的相關(guān)因素和找到新的可延緩DN進(jìn)展的治療方法已成為近年的研究熱點(diǎn)。轉(zhuǎn)分化后的腎小管上皮細(xì)胞喪失原有的上皮細(xì)胞表型，獲得肌成纖維細(xì)胞（MyoF）的新特征，特異性蛋白α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）是MyoF的標(biāo)志物。由腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化而來的MyoF具有更強(qiáng)的分泌細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的能力[2]，腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化是腎間質(zhì)MyoF的重要來源。有研究[3]已經(jīng)證實(shí)骨化三醇可通過干預(yù)免疫調(diào)節(jié)而發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。本研究復(fù)制DN大鼠，通過觀察骨化三醇對模型大鼠腎小管間質(zhì)中MyoFα-SMA和ECM重要成分纖維連接蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）的表達(dá)情況，探討骨化三醇對DN大鼠腎小管間質(zhì)損傷的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

HPIAS 1000高清晰度彩色病理圖像測量系統(tǒng)（武漢千屏影像有限責(zé)任公司）；強(qiáng)生血糖儀（美國強(qiáng)生公司）；7170A型全自動生化分析儀（日本日立公司）。

1.2 試藥

骨化三醇（上海羅氏公司，批號：J20100056，規(guī)格：每粒0.25 μg）；鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司，批號：S040103，規(guī)格：每支1 g）；兔抗大鼠α-SMA多克隆抗體、兔抗大鼠FN多克隆抗體和免疫組化試劑盒（福建邁新生物工程有限公司）；總RNA抽提試劑（Trizol，美國Invitrogen公司）；反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增（RT-PCR）試劑盒（上海申能生物工程有限公司）。

1.3 動物

SD大鼠28只，♂，體重200～280 g，購買并飼養(yǎng)于貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（黔）2006-0002。

2 方法

2.1 分組與建模

取大鼠28只，適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d后，隨機(jī)選取20只大鼠單次腹腔注射STZ 60 mg·kg－1（STZ溶于新制備的0.1 mol·L－1枸櫞酸鹽緩沖液）建立DN模型，其中4只大鼠未成模，給予剔除，造模成功的16只大鼠隨機(jī)分為模型組和干預(yù)組，每組8只。將剩余8只正常大鼠分為正常對照組。干預(yù)組在成模后立即灌胃給予骨化三醇0.03 μg·kg－1·d－1[4]（骨化三醇溶于橄欖油制備成混懸液）；模型組灌胃給予等量橄欖油；正常對照組灌胃給予等量蒸餾水。所有大鼠每日灌胃1次，連續(xù)12周。實(shí)驗(yàn)期間每周測量尾靜脈血糖2次，血糖過高（＞26.0 mmol·L－1）的大鼠皮下注射適量胰島素，維持隨機(jī)血糖在16.7 mmol·L－1水平以上。

2.2 標(biāo)本采集與血尿生化指標(biāo)檢測

末次給藥后，各組大鼠進(jìn)代謝籠收集24 h尿液，采用酶聯(lián)免疫分析法檢測24 h尿蛋白后處死大鼠，眼球取血并分離，采用7170A型全自動生化分析儀檢測血清中尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）含量。留取大鼠右腎組織置于10%福爾馬林固定液進(jìn)行組織病理學(xué)檢測和免疫組化檢查，留取大鼠左腎組織速凍于液氮中封存用于RT-PCR檢測。

2.3 腎組織病理學(xué)變化

各組大鼠腎組織固定，石蠟包埋，切片厚約3μm，行蘇木精-伊紅（HE）染色。對標(biāo)本進(jìn)行半定量評分。損傷評分標(biāo)準(zhǔn)[5]：0分為無小管損傷；0.5分為損傷＜5%；1.0分為損傷5%～20%；1.5分為損傷21%～35%；2.0分為損傷35%～50%；2.5分為損傷51%～65%；3.0分為損傷＞65%。

2.4 腎組織中α-SMA、FN表達(dá)的檢測

按照免疫組化試劑盒說明，采用免疫組化法檢測腎組織α-SMA、FN的表達(dá)，同時采用磷酸鹽緩沖液（PBS）代替一抗作為陰性對照。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性結(jié)果。每張切片在400倍視野下隨機(jī)選取10個腎小管間質(zhì)視野，以高清晰度彩色病理圖像測量系統(tǒng)對腎間質(zhì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行半定量分析，用積分吸光度（IOD）表示陽性物質(zhì)的相對含量。

2.5 腎組織中α-SMA、FN mRNA表達(dá)的檢測

腎皮質(zhì)總RNA提取按Trizol說明書進(jìn)行，取總RNA 2μL進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板分別用α-SMA、FN引物經(jīng)PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增。α-SMA引物序列為：上游5′-GGGTGATGGTGGGAATGG-3′，下游 5′-GCAGGGTGGGATGCTCTT-3′，褪火溫度為53℃，產(chǎn)物為278 bp；FN引物序列為上游：5′-TAGCCCTGTCCAGGAGTAAT-3′，下游 5′-CTGCAAGCCTTCGAGTACGA-3′，褪火溫度為56 ℃，產(chǎn)物為163 bp；重組人甘油三磷酸脫氫酶（GAPDH）引物序列為：上游5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′，下游5′-GGGTGTAACGCAACTAAG-3′，褪火溫度為55℃，產(chǎn)物為446 bp；PCR產(chǎn)物在溴乙錠染色的瓊脂糖凝膠上電泳后拍照。半定量測定PCR產(chǎn)物吸光度值與內(nèi)參GAPDH吸光度值的比值即為目的基因的mRNA的相對值。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料多組間比較采用方差分析，2組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 血尿生化指標(biāo)的變化情況

與正常對照組比較，模型組和干預(yù)組24 h尿蛋白定量、BUN、Scr含量均明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組24 h尿蛋白定量、Scr含量明顯降低（P＜0.05）。各組大鼠血尿生化指標(biāo)的變化見表1。

表1 各組大鼠血尿生化指標(biāo)的變化（±s，n＝8）Tab 1 Changes of biochemical parameters of serum and urine in each group（±s，n＝8）

表1 各組大鼠血尿生化指標(biāo)的變化（±s，n＝8）Tab 1 Changes of biochemical parameters of serum and urine in each group（±s，n＝8）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

Scr/μmol·L－1 51.2±10.2 201.3±39.1＊127.3±13.5＊#組別正常對照組模型組干預(yù)組24 h尿蛋白/mg·d－1 27.2±7.1 218.4±37.9＊124.6±18.2＊#BUN/mmol·L－1 5.1±0.9 12.5±3.6＊10.2±3.1＊

3.2 腎組織病理學(xué)變化

結(jié)果表明，正常對照組腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，間質(zhì)中少量炎細(xì)胞。模型組部分腎小管萎縮、管腔擴(kuò)大，近端小管上皮細(xì)胞刷狀緣減少或消失，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡變性，部分脫落，小管間質(zhì)區(qū)基質(zhì)增加，間質(zhì)內(nèi)見大量炎細(xì)胞浸潤。與模型組比較，干預(yù)組腎小管上皮細(xì)胞空泡變性情況改善，小管間質(zhì)區(qū)基質(zhì)增生情況有所減輕，間質(zhì)區(qū)炎癥細(xì)胞浸潤減少。3組腎小管損傷評分分別為（0.33±0.26）、（2.17±0.38）、（1.36±0.19），小管間質(zhì)損傷評分分別為（0.45±0.16）、（2.44±0.58）、（1.49±0.42）。與正常對照組比較，模型組腎小管和小管間質(zhì)損傷評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組腎小管和小管間質(zhì)損傷評分明顯降低（P＜0.05）。各組大鼠腎組織病理學(xué)變化見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理學(xué)變化（HE，×400）A.正常對照組；B.模型組；C.干預(yù)組Fig 1 Changes of renal tissue morphology of rats in each group（HE，×400）A.normal control group；B.model group；C.intervention group

3.3 腎組織中α-SMA、FN的表達(dá)情況

與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織中α-SMA、FN表達(dá)明顯增加（P＜0.05），細(xì)胞質(zhì)內(nèi)陽性物質(zhì)明顯增加；與模型組比較，干預(yù)組大鼠腎組織中α-SMA、FN表達(dá)明顯降低（P＜0.05），陽性物質(zhì)明顯減少。各組大鼠腎組織中α-SMA、FN表達(dá)的比較見表2，切片圖見圖2。

表2 各組大鼠腎組織中α-SMA、FN表達(dá)的比較（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of protein expression of α-SMA and FN in renal tissue of rats in each group（±s，n＝8）

表2 各組大鼠腎組織中α-SMA、FN表達(dá)的比較（±s，n＝8）Tab 2 Comparison of protein expression of α-SMA and FN in renal tissue of rats in each group（±s，n＝8）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對照組模型組干預(yù)組IOD FN 2.56±0.37 16.33±2.49＊7.07±0.65＊#α-SMA 3.43±1.13 14.2±6.38＊9.44±3.73＊#

圖2 各組大鼠腎組織中α-SMA、FN表達(dá)切片圖（×400）A.正常對照組；B.模型組；C.干預(yù)組Fig 2 Protein expression slices of α-SMA and FN in renaltissue of rats in each grou（p×400）A.normal control group；B.model group；C.intervention group

3.4 腎組織中α-SMA、FN mRNA的表達(dá)情況

與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織中α-SMA、FN mRNA表達(dá)明顯增加（P＜0.05）；與模型組比較，干預(yù)組大鼠腎組織中α-SMA、FN mRNA表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。各組大鼠腎組織中α-SMA、FN mRNA的半定量比較見表3，各組大鼠腎組織中α-SMA和FN mRNA表達(dá)的電泳圖見圖3（圖中N表示正常對照組，M表示模型組，D表示干預(yù)組）。

表3 各組大鼠腎組織中α-SMA、FN mRNA的半定量比較（±s，n＝8）Tab 3 Comparison of semi-quantitaty of α-SMA and FN mRNAin renal tissue of rats in each group（±s，n＝8）

表3 各組大鼠腎組織中α-SMA、FN mRNA的半定量比較（±s，n＝8）Tab 3 Comparison of semi-quantitaty of α-SMA and FN mRNAin renal tissue of rats in each group（±s，n＝8）

與正常對照組比較：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

組別正常對照組模型組干預(yù)組FN/GAPDH 0.142±0.051 1.194±0.047＊0.583±0.085＊#α-SMA/GAPDH 0.213±0.054 1.037±0.239＊0.633±0.102＊#

圖3 各組大鼠腎組織中α-SMA和FN mRNA表達(dá)的電泳圖Fig 3 Electrophoretogram of mRNA expression of α-SMA and FN in renal tissue of rats in each group

4 討論

DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，以往對DN的研究焦點(diǎn)主要集中在腎小球硬化，隨著對DN發(fā)病機(jī)制的不斷深入研究，腎小管病變及腎間質(zhì)纖維化在DN的發(fā)生、發(fā)展中的重要作用日益受到重視。而近年來，受損的腎小管上皮細(xì)胞向MyoF表型轉(zhuǎn)化這一獨(dú)特的能力越來越成為研究熱點(diǎn)，有可能為DN的治療提供新的治療思路。

DN腎間質(zhì)纖維化本質(zhì)是間質(zhì)ECM的過量堆積，MyoF分泌的Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型膠原和FN是ECM的主要成分。FN是一種始動因素，可能誘導(dǎo)Ⅳ型膠原的形成，促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化。Zhang等[6]發(fā)現(xiàn)骨化三醇可以阻止高糖誘導(dǎo)的FN和Ⅳ型膠原蛋白分泌。Li等[7]在培養(yǎng)的大鼠腎臟間質(zhì)纖維母細(xì)胞中證明骨化三醇可以呈劑量依賴性地抑制α-SMA表達(dá)，還可抑制Ⅰ型膠原的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，骨化三醇能夠抑制FN在DN大鼠的過度表達(dá)，從而減輕了腎小管間質(zhì)的纖維化。

α-SMA被認(rèn)為是MyoF的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)與腎間質(zhì)纖維化的程度正相關(guān)，Iwano等[8]應(yīng)用DNA示蹤技術(shù)在梗阻性腎病模型大鼠中觀察到，其腎間質(zhì)MyoF池約有36%是來自于腎小管上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。并且這些轉(zhuǎn)分化而來的MyoF能夠大量分泌ECM，加速腎小管間質(zhì)纖維化。本研究結(jié)果顯示，在DN大鼠腎組織中α-SMA表達(dá)明顯增加，提示在DN大鼠中存在腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)分化，而骨化三醇能夠下調(diào)α-SMA在腎小管間質(zhì)中的表達(dá)，提示骨化三醇能夠抑制病理狀態(tài)下的腎小管上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)分化，從而減少ECM合成，減輕腎小管和腎間質(zhì)的纖維化。

骨化三醇具有延緩慢性腎臟病進(jìn)展的潛能，本研究結(jié)果顯示：骨化三醇能夠減少DN大鼠尿蛋白，延緩Scr含量增加，減輕腎小管和間質(zhì)損傷和纖維化，其機(jī)制可能通過下調(diào)α-SMA和FN在腎小管間質(zhì)的表達(dá)，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞向MyoF轉(zhuǎn)分化，減輕ECM沉積，發(fā)揮其對DN大鼠的腎臟保護(hù)作用。

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