白麗娟，季中梅，李向東

(1.遼寧醫(yī)學院食品科學與工程學院，遼寧錦州121001;2.光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術國家重點實驗室，上海200436)

乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)產(chǎn)生的胞外多糖(exopolysaccharides，EPS)是指由乳酸菌在生長過程中產(chǎn)生并分泌于胞外、常滲入培養(yǎng)基中的一種糖類化合物［1］。自20 世紀40 年代人們利用腸膜狀明串珠菌成功開發(fā)出右旋糖苷(dextran)以來，乳酸菌EPS 的研究與應用引起了更多學者的興趣。近些年來，其獨特的物理學和流變學特性以及公認的食用安全性，使其在食品和非食品工業(yè)倍受青睞。乳酸菌胞外多糖是天然的生物增稠劑，它可以替代其它目前正在應用的、來源于非食品級細菌的穩(wěn)定劑或增稠劑，在發(fā)酵乳品、保健食品加工中具有重要的用途，因而在食品工業(yè)中具有廣闊的市場前景［2］。然而，乳酸菌胞外多糖的產(chǎn)量一般來說都比較低(50～425mg/L)，因此其應用也受到一定的限制。提高胞外多糖產(chǎn)量的研究，目前備受關注［3-4］。朱奇等選用1 株酸乳生產(chǎn)菌——嗜熱乳鏈球菌為出發(fā)菌株，采用紫外線和硫酸二乙酯進行復合誘變，得到EPS 產(chǎn)量高達965mg/L 的突變株，且具有良好的遺傳穩(wěn)定性［5］。本文通過對高產(chǎn)胞外多糖的米酒乳桿菌進行誘變篩選，試圖獲得誘變的優(yōu)良菌株，提高胞外多糖的產(chǎn)量，為以后工業(yè)生產(chǎn)使用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

米酒乳桿菌BXR - 5 - 3、保加利亞乳桿菌JCM1002、嗜熱鏈球菌IFO13597 由遼寧醫(yī)學院實驗室提供;MRS 液體和固體培養(yǎng)基、脫脂乳培養(yǎng)基、TPY 液體培養(yǎng)基 按文獻［6 -7］配制;蒽酮 上?；缮镉邢薰?無水葡萄糖、硫酸、K2HPO4、檸檬酸二銨、MnSO4·4H2O、醋酸鈉 均為分析純，濟南全旺化工有限公司。

ZKSJ-1000 型超凈工作臺 深圳市中科圣杰凈化設備有限公司;DHP-9082 型恒溫培養(yǎng)箱 上海壘固儀器有限公司;722 分光光度計 上海分析儀器廠;LGJ-10D 型真空冷凍干燥機 北京四環(huán)科學儀器廠有限公司;HH-1 型電子恒溫水浴鍋 上海醫(yī)療器械五廠;KX-99 型干燥箱 重慶實驗設備廠一分廠;XL-90 型低溫超速離心機 美國Beckman。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的制備 將實驗室保存的菌株，接種到經(jīng)滅菌的11.5%脫脂乳培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至凝乳，接種凝乳2% 于MRS 等合成培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24～26h，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 葡萄糖標準曲線的制備 取0.1g/L 的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL，用蒸餾水補至1.00mL，分別加入4.00mL 蒽酮試劑，迅速浸于冰水中冷卻，各管加完后一起浸于沸水浴中，管口加蓋玻璃球，以防蒸發(fā)。自水浴重新煮沸起，準確煮沸10min 取出，用自來水冷卻，室溫放置10min 左右，于620nm 比色，以同樣處理重蒸水為空白，進行比色。以葡萄糖每毫升含微克數(shù)為橫坐標，縱坐標為光密度值，繪制葡萄糖標準曲線，建立回歸方程，求胞外多糖含量。

1.2.3 不同紫外線照射距離和時間對乳酸菌誘變后胞外多糖產(chǎn)量的影響 將對數(shù)生長后期的出發(fā)菌培養(yǎng)液離心，用無菌生理鹽水將沉淀菌體稀釋成108cfu/mL，用直徑9cm 的平皿蓋裝菌液10mL，垂直置于15W 紫外線燈管下，分別選擇照射距離為10、15、20、25、30cm 照射1、5、10、15、20min，經(jīng)初篩，復篩，利用蒽酮-硫酸法測得多糖含量，選出高產(chǎn)胞外多糖的優(yōu)良菌株，并確定不同照射時間時的最佳照射距離。

1.2.4 不同濃度亞硝基胍對乳酸菌誘變后多糖產(chǎn)量的影響 分別選擇亞硝基胍濃度為100、200、300、400、500μg/mL 對米酒乳桿菌BXR-5-3 進行誘變，經(jīng)初篩，復篩，利用蒽酮-硫酸法測得多糖含量，選出高產(chǎn)胞外多糖的優(yōu)良菌株，并確定亞硝基胍的最佳濃度。

1.2.5 紫外線、亞硝基胍復合誘變對多糖產(chǎn)量的影響以1.2.3 和1.2.4 的實驗結果為基礎，選擇紫外線照射距離、亞硝基胍的濃度以及處理時間為主要影響因素進行L9(34)正交實驗。實驗設計如表1 所示。

表1 因素水平表Table 1 The table of factors and levels

1.3 誘變菌株的篩選

將誘變后的菌液用MRS 瓊脂平板避光培養(yǎng)，挑選20 個菌落較大、與出發(fā)菌株的菌落有一定差異性的菌落進行純培養(yǎng)，用MRS 瓊脂斜面保存。

1.3.1 高產(chǎn)胞外多糖米酒乳桿菌的初篩 取上述挑選出的菌落活化并取1mL 接入50mL MRS 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h 后經(jīng)分離純化胞外多糖后，以葡萄糖為參照標準繪制標準曲線，采用硫酸-蒽酮法測定多糖含量［8］。

1.3.2 高產(chǎn)胞外多糖的米酒乳桿菌的復篩 將初步篩選符合要求的菌株接種到50mL MRS 液體培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h，將培養(yǎng)液4℃、12000 ×g 冷凍離心30min，取上清液棄去菌體沉淀。按照1∶3 的料液比，95%酒精濃度(vol)，4℃條件下沉淀24h，上清液再次4℃、12000 ×g 冷凍離心30min，將離心得到的沉淀和酒精沉淀歸并，利用蒸餾水復溶［9］，透析24h，取出透析液定容至20mL。利用蒽酮-硫酸顯色法計算各誘變菌種所產(chǎn)生的多糖含量，找到多糖產(chǎn)量比較高的米酒乳桿菌誘變菌株。

1.4 分析方法

菌落培養(yǎng)及保存用MRS 瓊脂培養(yǎng)基;光密度采用722 分光光度計測定;pH 用酸度計測定;總糖含量采用硫酸-蒽酮法測定，以葡萄糖作為標準［10］。

2 結果與分析

2.1 不同紫外線照射距離和照射時間對乳酸菌誘變后胞外多糖產(chǎn)量的影響

選擇照射距離為10、15、20、25、30cm 分別照射1、5、10、15、20min 后，經(jīng)初篩，復篩，利用蒽酮-硫酸法測得多糖含量如圖1 所示。在距離為25cm 時照射10min 篩選到一株誘變菌株胞外多糖產(chǎn)量最高為305.2mg/L，其次是距離為20cm 時分別照射5min 和20min 篩選到兩株誘變菌株產(chǎn)量為289.5mg/L 和285.8mg/L。而在距離為15cm 時照射15min 篩選到的菌株產(chǎn)量最高為198.7mg/L，照射距離為10cm 和30cm 時菌株產(chǎn)量都非常低。

圖1 不同紫外線照射距離和照射時間誘變菌株胞外多糖的產(chǎn)量(n=3)Fig.1 Yield of exopolysaccharide in different distance and time of ultraviolet ray(n=3)

2.2 亞硝基胍的濃度對胞外多糖產(chǎn)量的影響

分別選擇亞硝基胍濃度為100、200、300、400、500μg/mL 對米酒乳桿菌BXR-5-3 進行誘變，經(jīng)初篩，復篩，利用蒽酮-硫酸法測得多糖含量如圖2 所示，隨著亞硝基胍濃度的增加，米酒乳桿菌變異菌株的胞外多糖產(chǎn)量也隨之增多，當亞硝基胍濃度達到300μg/mL 時，篩選出一株胞外多糖產(chǎn)量達到最高的菌株，多糖產(chǎn)量為322.7mg/L，隨后誘變菌株胞外多糖產(chǎn)量開始下降。

圖2 亞硝基胍的濃度對胞外多糖產(chǎn)量的影響(n=3)Fig.2 Effect of nitrosoguanidine concentration on yield of exopolysaccharide(n=3)

2.3 高產(chǎn)胞外多糖米酒乳桿菌的最佳誘變條件的選擇

以2.1 和2.2 的實驗結果為基礎，選擇紫外線照射距離、照射時間以及亞硝基胍的濃度為主要影響因素進行L9(34)正交實驗。實驗結果如表2 所示。

表2 紫外線、亞硝基胍復合誘變正交實驗結果Table 2 Result of orthogonal test to mutagenesis by ultraviolet ray-nitrosoguanidine

從表2 極差R 值可以看出，因素的主次關系為:B ＞C ＞A，其中亞硝基胍濃度對米酒乳桿菌胞外多糖的產(chǎn)量影響最為明顯，其次是處理時間和紫外線照射距離。正交實驗結果確定米酒乳桿菌產(chǎn)胞外多糖的最佳誘變條件組合為A2B2C3，即誘變劑量為300μg/mL，紫外線照射距離20cm，處理時間為20min，此時米酒乳桿菌胞外多糖產(chǎn)量最高為339.0mg/mL。

3 結論

3.1 經(jīng)紫外線照射，通過改變照射距離和處理時間，在照射距離為25cm，處理時間為10min 時，經(jīng)初篩，復篩等操作后得到一株符合要求的高產(chǎn)胞外多糖的誘變菌株，此菌株胞外多糖的產(chǎn)量為305.2mg/L。

3.2 經(jīng)亞硝基胍處理，通過改變亞硝基胍溶液的濃度，比較幾組濃度處理后乳酸菌的胞外多糖產(chǎn)量的情況，在濃度為300μg/mL 的亞硝基胍誘變后，得到一株符合要求的高產(chǎn)胞外多糖誘變菌株，此菌株的胞外多糖產(chǎn)量為322.7mg/L。

3.3 經(jīng)紫外線-亞硝基胍對米酒乳桿菌進行復合誘變，在誘變條件為紫外線照射距離為20cm，亞硝基胍的濃度為300μg/mL，處理時間為20min 得到一株符合要求的米酒乳桿菌誘變菌株，此時胞外多糖的產(chǎn)量為339mg/L。

經(jīng)實驗可知紫外線和亞硝基胍分別誘變后對米酒乳桿菌胞外多糖的產(chǎn)量均有很大影響，尤其是紫外線和亞硝基胍復合誘變后獲得胞外多糖產(chǎn)量比紫外線和亞硝基胍單獨誘變稍高，并且不同誘變劑量與不同處理時間組合誘變的菌株也差別很大。

4 討論

已知出發(fā)菌株米酒乳桿菌BXR-5-3 在最適條件下最大合成量為78.86mg/L［6］，經(jīng)過紫外線和亞硝基胍復合誘變后所得菌株胞外多糖最大產(chǎn)量為339.0mg/L，是原菌株產(chǎn)量的4 倍多，雖然產(chǎn)量提高很明顯，但是還不能滿足工業(yè)化生產(chǎn)的需要，可為日后的工業(yè)化生產(chǎn)和滿足人們對于胞外多糖日益增長的需求奠定堅實的基礎。近年來，隨著生物工程技術的發(fā)展，基因工程技術已應用到菌種的改造方面，使育種工作朝著更快捷、更高效的方向發(fā)展，胞外多糖高產(chǎn)菌株的分子育種研究有待進一步開展。

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［3］李盛鈺，曾憲鵬，楊貞耐.提高乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量的途徑［J］.食品與生物技術學報，2009(3):1-5.

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