劉培福，何付麗,，曲春鶴，紀(jì)明山，趙長山

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽 110161）

由腐皮鐮孢菌（Fusarium solani）侵染引起的辣椒根腐病，是一種典型的土傳病害。該病主要危害根部，病部皮層下呈淡或深褐色[1-2]，一般年份發(fā)病率10%，重時達(dá)20%～30%，重病地塊甚至達(dá)50%[3]。目前，國內(nèi)外系統(tǒng)研究辣椒根腐病的較少，現(xiàn)有的土壤消毒劑中，防效有限，熏蒸劑高毒且價昂，操作麻煩；采取換地移棚的防治方法，不僅使投資增加且局限性強(qiáng)，限制了棚菜生產(chǎn)的發(fā)展[4-5]。利用拮抗細(xì)菌及其發(fā)酵產(chǎn)物防治辣椒根腐病是一種具應(yīng)用前景的探索[6]。為了實(shí)現(xiàn)拮抗細(xì)菌的工業(yè)化生產(chǎn)，必須優(yōu)化細(xì)菌的發(fā)酵條件，目前關(guān)于拮抗細(xì)菌的發(fā)酵培養(yǎng)主要包括液態(tài)發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵[7-8]。D221菌株是從辣椒根際土壤中分離得到的，經(jīng)過離體和活體實(shí)驗(yàn)測定，該菌株對辣椒根腐病病原菌有良好的拮抗活性。本試驗(yàn)研究了D221菌株的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基成分、發(fā)酵條件對該菌生長和產(chǎn)生抗菌物質(zhì)能力的影響，為其發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)，并為進(jìn)一步利用該菌株產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)開發(fā)創(chuàng)新農(nóng)藥奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

拮抗細(xì)菌D221，從生長健康的辣椒植株根際土壤中分離、篩選獲得。病原指示菌，辣椒根腐病菌（Fusarium solani），由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基，牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖5.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1 000 mL；原始發(fā)酵培養(yǎng)基，牛肉膏3.0 g、蛋白胨5.0 g、葡萄糖10.0 g、NaCl 5.0 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基組分的篩選

分別用10 g·L-1葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、糊精、甘油、玉米淀粉代替原始培養(yǎng)基中的碳源，以不加碳源的處理為對照；分別用10 g·L-1蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母膏、尿素、（NH4）2SO4、NH4NO3、NH4Cl和KNO3代替原始培養(yǎng)基中的氮源，以不加氮源的處理為對照；分別用5 g·L-1MgSO4、CH3COONa、K2HPO4、CaCO3、CuSO4、ZnSO4代替原始培養(yǎng)基中的NaCl，以不加無機(jī)鹽的處理為對照。進(jìn)行單因子試驗(yàn)，各處理3次重復(fù)，通過不同碳源、氮源、無機(jī)鹽對菌株生長量和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響，選擇最佳的碳源、氮源和無機(jī)鹽。

1.2.2 培養(yǎng)基組分的優(yōu)化

根據(jù)1.2.1的篩選結(jié)果，碳源選擇蔗糖，氮源選擇牛肉膏和胰蛋白胨，無機(jī)鹽選擇NaCl和MgSO4，按正交設(shè)計(jì)表L16（45）安排試驗(yàn)，根據(jù)各處理產(chǎn)抗菌物質(zhì)的能力優(yōu)化培養(yǎng)基組分。

1.2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以1.2.2優(yōu)化出的培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，溫度30℃，接種量10%，轉(zhuǎn)速150 r·min-1，培養(yǎng)48 h為初始條件。將溫度分別設(shè)為15、20、25、30、35、40℃；初始pH分別設(shè)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0；接種量分別設(shè)為1%、3%、5%、7%、10%、13%；通氣量設(shè)定為250 mL搖瓶裝液量10、30、50、80、100、120、150 mL；搖床轉(zhuǎn)速分別設(shè)為50、100、150、200 r·min-1；培養(yǎng)時間分別設(shè)為 16、24、32、40、48、56、64、72 h。進(jìn)行單因子試驗(yàn)，各處理3次重復(fù)。根據(jù)D221菌株在不同發(fā)酵條件下的產(chǎn)量和無菌濾液的抑菌活性選擇最佳發(fā)酵條件。

1.2.4 菌體生長量的測定方法

利用SP-1900UVPC型分光光度計(jì)測定不同濃度D221菌懸液在625 nm處的吸收值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)菌懸液吸收值計(jì)算其含菌量（標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1.3484x+6.9559，R2=0.806）。

1.2.5 無菌發(fā)酵液抑菌活性的測定

利用孔碟法測定拮抗細(xì)菌D221無菌發(fā)酵濾液抑菌活性[9]。將D221菌株發(fā)酵液在10 000 r·min-1下離心20 min，取上清液在0.22 μm微孔濾膜過濾器中過濾得到無菌濾液，制備含辣椒根腐病病原菌孢子的PDA平板，用打孔器在平板上等距打兩個孔，每個孔內(nèi)加無菌濾液80 μm，重復(fù)3次，30℃培養(yǎng)2 d，測抑菌圈大小[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基各成分的優(yōu)化

由表1可以看出，所試碳源對D221菌株的生長量和產(chǎn)抗菌物質(zhì)能力都有促進(jìn)作用。抑菌圈直徑從大到小依次為蔗糖＞葡萄糖＞甘油＞麥芽糖＞可溶性淀粉＞乳糖＞糊精＞玉米粉。蔗糖的抑菌圈直徑為18.5 mm，并且菌株產(chǎn)量也達(dá)到了1.95×108cfu·mL-1，效果明顯優(yōu)于其他碳源，因此選擇蔗糖為D221菌株的最佳碳源。

表1 不同碳源對菌株生長量和產(chǎn)拮抗物質(zhì)的影響Table 1 Effect of different carbohydrate sources on growth and antimicrobial activity of strain D221

由表2可知，D221菌株不能利用供試的無機(jī)氮源；有機(jī)氮源中，蛋白胨的產(chǎn)量最高，但其抑菌圈直徑較小。而胰蛋白胨和牛肉膏的抑菌圈直徑明顯大于其他氮源，且菌株產(chǎn)量也較高，因此選擇胰蛋白胨和牛肉膏為最佳氮源。

表2 不同氮源對菌株生長量和產(chǎn)拮抗物質(zhì)的影響Table 2 Effect of different nitrogen sources on growth and antimicrobial activity of strain D221

由表3可知，D221菌株在以NaCl和MgSO4為無機(jī)鹽的培養(yǎng)基中產(chǎn)抗菌物質(zhì)的能力較強(qiáng)，且產(chǎn)量也較高。因此，無機(jī)鹽選擇NaCl和MgSO4。

表3 不同無機(jī)鹽對菌株生長量和產(chǎn)拮抗物質(zhì)的影響Table 3 Effect of different inorganic salt sources on growth and antimicrobial activity of strain D221

2.2 培養(yǎng)基成分含量的優(yōu)化

根據(jù)表4顯示，5種培養(yǎng)基成分對D221菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)能力的影響大小依次為：蔗糖＞牛肉膏＞胰蛋白胨＞NaCl＞MgSO4。各因素的最佳水平為A3B2C4D3E1。因此，D221菌株產(chǎn)抗菌物質(zhì)的最佳培養(yǎng)基組成為蔗糖2.0%，胰蛋白胨0.5%，牛肉膏2.0%，NaCl 0.5%，MgSO40.1%。

2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

由圖1可以看出，D221菌株生長最適溫度在30℃左右，而且菌體生長溫度與產(chǎn)抗菌物質(zhì)的要求基本一致，即30℃時，菌株最大生長量為3.4×108cfu·mL-1，抑菌圈直徑最大達(dá)24.8 mm。隨溫度升高，菌株產(chǎn)量明顯下降，說明溫度偏高不利于菌株生長。選用30℃為D221菌株最佳發(fā)酵溫度。

發(fā)酵液的初始pH對該菌株產(chǎn)量和產(chǎn)抗菌物質(zhì)能力影響很大，如圖2結(jié)果顯示，當(dāng)pH 6～7時，菌株產(chǎn)量和抑菌圈直徑達(dá)到最大值。隨著pH升高，菌株產(chǎn)量和抑菌活性迅速下降。當(dāng)pH 8～9時，發(fā)酵液基本沒有抑菌效果。說明堿性條件對D221菌株有抑制作用，弱酸有利于菌株生存，本試驗(yàn)選擇pH 7為最佳D221菌株的最佳發(fā)酵環(huán)境。

從圖3可以看出，菌株生長量隨著時間的延長而增加，到40 h菌株產(chǎn)量達(dá)到高峰并且趨于穩(wěn)定。當(dāng)培養(yǎng)時間為16 h時，發(fā)酵液基本沒有抗菌活性。抗菌物質(zhì)在40～56 h產(chǎn)量達(dá)到最大值，綜合菌株生長量和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的能力的結(jié)果，本試驗(yàn)選擇48 h為最佳發(fā)酵時間，此時抑菌圈直徑為25.1 mm；菌株產(chǎn)量為3.89×108cfu·mL-1。

表4 L16（45）正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Factors and levels of L16（45）orthogonal test

圖1 不同溫度對菌株生長和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.1 Effect of different temperatures on growth and antagonistic substance of strain D221

圖2 pH對菌株生長和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different pH on growth and antagonistic substance of strain D221

圖3 培養(yǎng)時間對菌株生長和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.3 Effect of cultivation time on growth and antagonistic substance of strain D221

接菌量為3%～7%時，菌株產(chǎn)量和產(chǎn)抗菌物質(zhì)能力達(dá)到高峰。隨接菌量增加，菌株生長量和產(chǎn)抗菌物質(zhì)能力都下降。當(dāng)接菌量達(dá)到10%時（見圖4），二者變化趨與穩(wěn)定。本試驗(yàn)選用5%接菌量，此時抑菌圈直徑達(dá)最大24.8 mm，菌株產(chǎn)量為3.91×108cfu·mL-1。

菌株發(fā)酵通氣量可通過三角瓶內(nèi)培養(yǎng)基的裝液量來控制，從圖5可以看出，菌株生長量和抑菌圈直徑對通氣量的要求基本一致。結(jié)果表明，當(dāng)在250 mL的三角瓶中加入液體培養(yǎng)基量為10～50 mL時，菌株生長量達(dá)到最大值。當(dāng)裝液量為30 mL時，拮抗物質(zhì)的抑菌圈直徑最大達(dá)25.2 mm。

圖4 接菌量對菌株生長和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.4 Effect of different inoculation volume on growth and antagonistic substance of strain D221

圖5 通氣量對菌株生長和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.5 Effect of different medium volume on growth and antagonistic substance of strain D221

搖床轉(zhuǎn)速是影響搖瓶培養(yǎng)基中通氣狀況的重要因素。菌體發(fā)酵活性產(chǎn)物一般都是好氧過程（見圖6）。

由圖6可知，結(jié)果表明轉(zhuǎn)速為150 r·min時抑菌效果最好，抑菌圈直徑為24.9 mm，過低及過高轉(zhuǎn)速對發(fā)酵均不利。只有合適的轉(zhuǎn)速(150 r·min)滿足發(fā)酵所需溶氧量時，發(fā)酵液內(nèi)活性物質(zhì)性最強(qiáng)。當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速為50 r·min時，發(fā)酵液基本沒有抗菌活性。

圖6 轉(zhuǎn)數(shù)對菌株生長和產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.6 Effect of different shaker rotation speed on growth and antagonistic substance of strain D221

2.4 培養(yǎng)條件優(yōu)化后產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的能力

優(yōu)化后實(shí)測抑菌圈直徑為31.5 mm，而原始發(fā)酵條件下的抑菌圈直徑為18.9 mm，因此優(yōu)化后抑菌圈直徑提高了66.7%（見圖7）。

圖7 優(yōu)化培養(yǎng)條件后產(chǎn)抗菌物質(zhì)能力與原始發(fā)酵條件的比較Fig.7 Comparison of the ability of produced antagonistic substance in optimized medium with original

3 討論

a.本試驗(yàn)通過單因子和正交試驗(yàn)對培養(yǎng)基成分進(jìn)行了優(yōu)化，但是對發(fā)酵條件的優(yōu)化只進(jìn)行單因子試驗(yàn)，雖然也得到了一些結(jié)論，但是如果想更加全面的了解該菌株的發(fā)酵條件，還得需要對這幾個不同的發(fā)酵條件進(jìn)行正交試驗(yàn)。

b.本試驗(yàn)在室內(nèi)搖瓶條件下進(jìn)行，為工業(yè)大規(guī)模發(fā)酵提供參考。下一步將用自動發(fā)酵罐進(jìn)行驗(yàn)證發(fā)酵，以獲得更多、更詳盡的優(yōu)化參數(shù)，為生產(chǎn)放大做好鋪墊。

c.本試驗(yàn)以胰蛋白胨和牛肉膏作為發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分，雖然得到的發(fā)酵液抑菌活性很高，但成本也高，是否可用其他更便宜的材料替代，應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步試驗(yàn)。

d.利用生防菌防治植物土傳病害所涉及的影響因素很多，其作用方式各不相同。目前研究比較清楚的主要有重寄生、抗生作用、生態(tài)位點(diǎn)競爭以及誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性等幾個方面。以上幾種作用并不相互排斥，往往是協(xié)同作用。拮抗細(xì)菌D221的抗菌機(jī)理，抗菌物質(zhì)的活性成分是什么，抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性等，都有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

a.以2.0%蔗糖作為碳源時菌株產(chǎn)量和抑菌活性都是最高的；D221菌株不能有效利用無機(jī)氮源，但是能夠很好的利用有機(jī)氮源，其中0.5%胰蛋白胨和2.0%牛肉膏效果最顯著；供試的無機(jī)鹽對D221菌株的抑菌活性均有影響，0.5%NaCl和0.1%MgSO4能明顯提高D221抑菌活性，但是CuSO4和ZnSO4會抑制菌株生長，抗菌活性有所降低。

b.在250 mL三角瓶內(nèi)裝入30 mL優(yōu)化后的培養(yǎng)基，把初始pH調(diào)至7.0，按5%接種量接入D221種子液，溫度30℃，在150 r·min-1的轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)48 h得到的無菌發(fā)酵液抑菌活性最高。

c.D221菌株生長快，易產(chǎn)生拮抗物質(zhì)，對辣椒根腐病有較好的防治作用，是一種很有潛力的生防菌，本試驗(yàn)最終確定了D221菌株產(chǎn)拮抗物質(zhì)的最適培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，為該菌株的進(jìn)一步研究與開發(fā)應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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