李昆侖，柏 錫，盧 姍，袁 悅，李 勇，紀(jì) 巍，才 華，季佐軍，朱延明

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

植物的逆境應(yīng)答是一個(gè)很復(fù)雜的生物學(xué)過程，當(dāng)植物受到外界環(huán)境脅迫后，會(huì)引發(fā)體內(nèi)一系列的生理生化反應(yīng)，并最終通過信號傳導(dǎo)過程誘導(dǎo)或者抑制某些基因的表達(dá)，以避免或減少逆境對自身的危害[1]。近年來，通過基因芯片等分子生物學(xué)技術(shù)，篩選出一批受逆境誘導(dǎo)表達(dá)的基因[2]。野生大豆是栽培大豆的近緣野生種，在我國分布廣泛，類型豐富。具有抗逆性和適應(yīng)能力強(qiáng)、產(chǎn)量性狀突出等眾多優(yōu)良性狀，野生大豆具有很強(qiáng)的抗逆性和適應(yīng)能力，是利用基因工程手段進(jìn)行作物抗逆分子育種的重要基因來源供體材料[3]。

GASA（Gibberbllic acid-stimulated inArabidopsis）基因家族是近年來研究較多的一類受GA調(diào)控的基因家族[4]。第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的GASA基因家族成員是由Shi等在赤霉素缺失的番茄突變體gib1中分離得到的，后陸續(xù)從番茄[5]、矮牽牛[6]、馬鈴薯[7]、水稻[8]、非洲菊[9]、擬南芥[4]等中獲得了同源基因。已有的研究表明，大多數(shù)GASA基因受GA調(diào)控。例如，GA誘導(dǎo)番茄中GAST1的表達(dá)，而GAST1的另一個(gè)同源基因RSI-1的表達(dá)則受生長素的誘導(dǎo)[5]；赤霉酸（GA3）誘導(dǎo)矮牽牛中分離得到的4個(gè)GIP同源基因（GIP1、GIP2、GIP4和GIP5）的表達(dá)[6]；GA3促進(jìn)水稻和GA合成缺失突變體中OsGASR1和OsGASR2的表達(dá)[8]；GA誘導(dǎo)非洲菊（Gerbera hybrida）GEG基因在花冠和心皮中表達(dá)[9]。在非生物脅迫方面，研究表明GASA基因可以響應(yīng)多種逆境脅迫并在其中起到重要作用，如Snakin-2基因在受到機(jī)械損傷下顯著上調(diào)表達(dá)，超量表達(dá)后可以提高對病原體的抵抗能力[7]；擬南芥GASA4基因的表達(dá)在熱激處理下短時(shí)間內(nèi)迅速積累[10]，超量表達(dá)后也提高了轉(zhuǎn)基因植株耐熱性[10]。

本研究在前期構(gòu)建的野生大豆堿脅迫芯片表達(dá)譜中選取了兩個(gè)在堿脅迫中顯著上調(diào)表達(dá)并且經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測屬于GASA基因家族的基因[11]，分別命名為GsGASA1、GsGASA2。進(jìn)一步檢測其在不同非生物脅迫條件及激素處理下的表達(dá)模式，為研究GsGASA1和GsGASA2基因在植物逆境脅迫應(yīng)答方面的功能及其作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，也為綜合改良作物耐鹽堿能力提供基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料為野生大豆（G07256），采自吉林省白城地區(qū)鹽堿地，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物生物工程研究室提供。

1.2 野生大豆的處理

用濃硫酸處理10 min以消化泥膜，蒸餾水洗凈，播種于由營養(yǎng)土和蛭石按1∶1比例配制成的基質(zhì)中，培養(yǎng)21 d后，洗凈根部，分別用50 mmol·L-1NaHCO3、100 mmol·L-1NaCl、30%PEG（W/V）、4 ℃、100 μmol·L-1GA3、10 μmol·L-1PAC、100 μmol·L-1ABA進(jìn)行處理，以未處理的野生大豆幼苗作為對照（0 h），取樣時(shí)間為處理后0.5、1、3、6和12 h。用NaHCO3處理的材料，取幼嫩的根和葉，其他方式處理的材料，取幼嫩的根。

1.3 總RNA的提取與cDNA第一鏈的合成

采用天根公司RNA提取試劑盒并按照其說明提取總RNA。取RNA 5 μg，采用Invitrogen公司的SuperScript II反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒合成雙鏈cDNA。

1.4 生物信息學(xué)預(yù)測

應(yīng)用在線工具InterProScan（http://www.ebi.ac.uk/Tools/InterProScan/）預(yù)測目的基因編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域、信號肽和跨膜區(qū)。利用DNAMAN分析蛋白質(zhì)序列之間的相似性。

1.5 半定量RT-PCR分析

內(nèi)參采用β-Actin，擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性7 min，94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，26個(gè)循環(huán)。GsGASA1、GsGASA2基因的表達(dá)分析使用相應(yīng)數(shù)量的cDNA，反應(yīng)條件與內(nèi)參的相同，PCR擴(kuò)增均進(jìn)行26個(gè)循環(huán)。用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。進(jìn)行兩次重復(fù)。應(yīng)用ImageJ軟件（http://rsbweb.nih.gov/ij/）計(jì)算目的基因的相對吸光值。所用的引物序列如下：

GsGASA1-Sense 5'CACATATCATAGCAATGGC AGCAC 3'；

GsGASA1-RTSense 5'ATTTGGGTCCTCCTTCCT TGG 3'；

GsGASA2-Sense 5'AATGGCTAAGTTCTTTGCTG CTATG 3'；

GsGASA2-RTSense 5'CTCCTTCCTTGGTCTTCC AGTTG 3'；

β-Actin-Sense 5'GAAGATGGCAGACGCTGAG GAT 3'；

β-Actin-Antisense 5'ACGACCTACAATGCTGG GTAACAC 3'。

2 結(jié)果與分析

2.1 GsGASA1、GsGASA2基因的獲得

利用實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的野生大豆堿脅迫基因芯片表達(dá)譜，篩選得到了兩個(gè)在鹽堿脅迫下明顯上調(diào)的候選基因（probset分別為Gma.15958.1.S1_at；GmaAffx.90343.1.S1_at)。根據(jù)芯片雜交結(jié)果，這兩個(gè)基因在栽培大豆基因組數(shù)據(jù)庫中對應(yīng)同源基因的GlymaID分別為Glyma02g41280.1、Glyma18g49400.1。應(yīng)用在線工具Interproscan對Glyma02g41280.1、Glyma18g49400.1基因編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域、信號肽和跨膜區(qū)預(yù)測（見圖1）。預(yù)測結(jié)果表明，這兩個(gè)基因都具有GASA基因家族共同的結(jié)構(gòu)特征，由100個(gè)左右氨基酸組成，在N端均有一可剪切的信號肽，分別由27、24個(gè)氨基酸組成，因此可能屬于分泌蛋白。在緊接信號肽下游，含有一個(gè)親水區(qū)域，由22～23個(gè)親水氨基酸組成。C端含有60個(gè)氨基酸的GASA結(jié)構(gòu)域，其中包括12個(gè)保守的半胱氨酸殘基，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測表明兩個(gè)蛋白在N端都有一個(gè)跨膜區(qū)。根據(jù)野生大豆和栽培大豆之間序列的高度相似性，推測野生大豆中的這兩個(gè)基因也屬于GASA基因家族，因此分別命名為GsGASA1、GsGASA2基因，并且推測GsGASA1和GsGASA2基因編碼的蛋白質(zhì)也同樣屬于分泌蛋白，它們各自的信號肽可能將引導(dǎo)其成熟產(chǎn)物定位于細(xì)胞壁。另外，由于GsGASA1、GsGASA2基因序列較短，僅編碼100個(gè)左右的氨基酸，可以推測C端60個(gè)氨基酸構(gòu)成的GASA結(jié)構(gòu)域?qū)虻墓δ苁欠浅Ｖ匾?。利用DNAMAN對Glyma02g41280.1與Glyma18g49400.1基因所編碼的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)二者一致性達(dá)60%（見圖2）。同樣根據(jù)野生大豆和栽培大豆序列的高度相似性，我們可以推測GsGASA1基因和GsGASA2基因分別所編碼的蛋白質(zhì)序列之間的相似性也在60%左右。

2.2 GsGASA1、GsGASA2基因芯片結(jié)果的sqRTPCR驗(yàn)證

野生大豆中NaHCO3處理下GsGASA1、GsGASA2基因的sqRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果表明（見圖3），GsGASA1基因在根中于0.5 h時(shí)出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，這種上調(diào)趨勢維持到1 h，在3 h開始下降，在處理6 h時(shí)再次出現(xiàn)上升，隨后在12 h恢復(fù)至處理前的表達(dá)水平。GsGASA2基因在根中也于0.5 h時(shí)出現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)，而后一直到處理12 h都呈現(xiàn)下降的趨勢。因此，堿脅迫處理下，GsGASA1、GsGASA2基因在野生大豆根中的sqRT-PCR結(jié)果和在基因芯片表達(dá)譜中表達(dá)模式相比較[11]，雖然GsGASA1、GsGASA2基因的表達(dá)峰度大小存在一定差異，但是變化趨勢一致，均呈現(xiàn)在根中堿脅迫處理短時(shí)間內(nèi)迅速上調(diào)表達(dá)隨后恢復(fù)到最初的表達(dá)水平的變化模式，進(jìn)一步驗(yàn)證了基因芯片結(jié)果。另外，在葉中，GsGASA1基因的表達(dá)量出現(xiàn)先下降再上升的趨勢，最終回到脅迫處理前的表達(dá)水平。GsGASA1基因在根和葉中表達(dá)模式的不同表明在堿脅迫反應(yīng)中GsGASA1基因在野生大豆不同部位所參與的調(diào)控模式不同。而GsGASA2基因可能由于時(shí)間延遲的原因在處理3 h才出現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)，隨后下降至處理前的表達(dá)水平。以上結(jié)果表明，GsGASA1和GsGASA2基因均響應(yīng)堿脅迫，作為候選基因用于下一步試驗(yàn)。

2.3 非生物脅迫及激素處理下GsGASA1、GsGA SA2基因的表達(dá)情況

通過sqRT-PCR來檢測野生大豆根中GsGA SA1、GsGASA2基因在另外三種非生物脅迫—鹽、干旱、低溫處理下的表達(dá)情況。圖4的結(jié)果表明，GsGASA1、GsGASA2基因均可以被NaCl、PEG、4℃誘導(dǎo)表達(dá)。然而兩個(gè)基因在這三種脅迫處理下的表達(dá)模式是不同的，GsGASA1基因在三種脅迫處理下，均迅速在0.5 h出現(xiàn)明顯上調(diào)表達(dá)，特別是在干旱處理下，在1 h達(dá)到高峰，隨后下降。GsGASA2基因在NaCl處理下，也在0.5 h出現(xiàn)上調(diào)，但直到12 h才開始下降，而在干旱處理下，表達(dá)變化沒有GsGASA1基因的顯著，但也在短時(shí)間內(nèi)上調(diào)，在3 h達(dá)到最大值。綜上所述，GsGASA1、GsGASA2基因除了響應(yīng)堿脅迫外，還參與到鹽、干旱、低溫三種脅迫中，并且在這四種脅迫處理中均呈現(xiàn)在短期內(nèi)顯著上調(diào)表達(dá)的模式。通過蛋白質(zhì)序列比對分析發(fā)現(xiàn)GsGASA1與GsGASA2基因所編碼的蛋白質(zhì)序列一致性較高（達(dá)60%左右），這可能是GsGASA1與GsGASA2基因在堿、鹽、干旱、低溫四種非生物脅迫以及激素處理下表達(dá)模式相似的原因。由此我們推測GsGASA1和GsGASA2基因在植物應(yīng)答非生物脅迫反應(yīng)中將起到一定作用。

圖1 Glyma02g41280.1、Glyma18g49400.1基因InterProScan預(yù)測結(jié)果Fig.1 Predict result of Glyma02g41280.1,Glyma18g49400.1 by InterProScan

圖2 Glyma02g41280.1、Glyma18g49400.1基因編碼蛋白質(zhì)序列比對結(jié)果Fig.2 NCBI Blast result of Glyma02g41280.1,Glyma18g49400.1 amino acid sequence

圖3 GsGASA1、GsGASA2基因在NaHCO3脅迫的表達(dá)特性分析結(jié)果Fig.3 Expression patterns of GsGASA1,GsGASA2 gene in response to NaHCO3treatments

圖4 野生大豆根中GsGASA1、GsGASA2基因在不同非生物脅迫、不同激素處理的表達(dá)模式Fig.4 Expression patterns of the GsGASA1,GsGASA2 gene in response to various treatments and plant hormones

另外，GA3處理下GsGASA1基因在12 h明顯上調(diào)表達(dá)，GsGASA2基因在處理6 h時(shí)就開始上升，但是上升程度沒有GsGASA1基因顯著，而在GA生物合成抑制劑PAC處理下，GsGASA1、GsGASA2基因的表達(dá)均明顯受到抑制（見圖4）。因此GsGASA1、GsGASA2基因的表達(dá)可能受到GA的誘導(dǎo)。而GsGASA1、GsGASA2基因在GA處理下表現(xiàn)出先下調(diào)才上調(diào)的表達(dá)特點(diǎn)，可能與GA信號通路的反饋抑制特點(diǎn)有關(guān)。另外，在與GA互為拮抗劑的ABA處理下，GsGASA1、GsGASA2基因均表現(xiàn)出明顯下調(diào)的趨勢。因此，可以推測GsGASA1與GsGASA2基因的表達(dá)均受到GA的誘導(dǎo)以及ABA的抑制。

3 討論與結(jié)論

通過野生大豆中GsGASA1與GsGASA2基因在堿、鹽、干旱、冷脅迫下能被誘導(dǎo)表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果，可初步證明GsGASA1與GsGASA2基因均響應(yīng)多種非生物脅迫，進(jìn)而可能與野生大豆的耐逆性有關(guān)，這為以后進(jìn)行GsGASA1、GsGASA2基因全長基因的克隆以及在非生物脅迫方面的功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)。大多數(shù)GASA基因的表達(dá)都受GAs的正向調(diào)控，如GA促進(jìn)GASA家族中的GIP1[6]、GEG[9]、AtGASA4[4]、OsGASR[8]等的表達(dá)。對野生大豆施加外源GA3和ABA處理后，GsGASA1、GsGASA2基因表達(dá)分析的試驗(yàn)結(jié)果表明（見圖4），GsGASA1、GsGASA2基因?qū)ν庠醇に氐捻憫?yīng)基本一致，都受GA3的誘導(dǎo)，受PAC和ABA的抑制。說明GsGASA1、GsGASA2基因可能受GA和ABA的雙重調(diào)控。本研究結(jié)果表明，GsGASA1、GsGASA2基因可能是GA和ABA這兩種重要植物激素信號的整合子，為研究GA和ABA的相互作用提供了重要線索。下一步準(zhǔn)備將GsGASA1與GsGASA2基因?qū)δＪ街参飻M南芥超量表達(dá)，從而分析其在非生物脅迫處理下的抗性以及進(jìn)一步探討功能機(jī)理。

本研究在前期構(gòu)建的野生大豆堿脅迫基因芯片表達(dá)譜中選取了兩個(gè)經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測屬于GASA家族的兩個(gè)基因，分別命名為GsGASA1、GsGASA2，通過sqRT-PCR驗(yàn)證了芯片結(jié)果。另外，發(fā)現(xiàn)GsGASA1與GsGASA2基因除了響應(yīng)堿脅迫處理外，均還受到鹽、干旱以及低溫脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，并且在這四種非生物脅迫處理下均呈現(xiàn)短期內(nèi)顯著上調(diào)表達(dá)的模式，推測GsGASA1與GsGASA2基因可能在植物逆境脅迫應(yīng)答反應(yīng)中起到作用。另外GsGASA1與GsGASA2基因的表達(dá)均受到GA的誘導(dǎo)和ABA的抑制。本研究將為研究GsGASA1和GsGASA2基因在非生物脅迫中的功能以及在GA和ABA信號通路中的作用奠定基礎(chǔ)。

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