黃 斌，張 達(dá)，李 洋，張 霞，郝再彬,

（1.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林 541004；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

近年來,由于工業(yè)的迅猛發(fā)展，工業(yè)“三廢”的排放，使得大面積的土壤受到了重金屬的污染[1]。土壤中的重金屬可經(jīng)水、大氣及生物鏈最終危害人體健康，且此類污染具有長期性、隱蔽性和不可逆性的特點，可見各種重金屬對環(huán)境的污染及破壞已嚴(yán)重危害到人們的身心健康、制約了經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，因此尋求治理此類污染的辦法迫在眉睫。近些年來，利用植物修復(fù)環(huán)境已成為污染治理研究領(lǐng)域的一個前沿性課題并引起了人們的廣泛重視[2]。植物修復(fù)（Phytoremediation）是利用綠色植物來轉(zhuǎn)移、容納或轉(zhuǎn)化污染物使其對環(huán)境無害[3]。植物修復(fù)的對象是重金屬、有機物或放射性元素污染的土壤及水體[4-5]。研究表明，通過植物的吸收、揮發(fā)、根濾、降解、穩(wěn)定等作用，可以凈化土壤或水體中的污染物，達(dá)到凈化環(huán)境的目的，因而植物修復(fù)是一種很有潛力、正在發(fā)展的清除環(huán)境污染的綠色技術(shù)。該技術(shù)具有成本低、不破壞土壤和河流生態(tài)環(huán)境、不引起二次污染等優(yōu)點[6]。

廣西北部某電鍍廠排污口發(fā)現(xiàn)的一種植物—李氏禾，其對鉻具高富集能力已被張學(xué)洪等證實[7]，這為鉻污染土壤的人工濕地修復(fù)技術(shù)提供了一種新的植物種類。目前，大量的研究表明，鉻脅迫對植物的生理和結(jié)構(gòu)都會造成嚴(yán)重影響[8-9]，而李氏禾對鉻的耐性機理卻少有報道。本文以不同來源李氏禾為材料，通過對比不同來源李氏禾在正常以及鉻污染環(huán)境中生理生化指標(biāo)的差異，分析了在一定鉻濃度脅迫下，李氏禾各項生理生化指標(biāo)的變化，探討其對重金屬污染的耐受性，為篩選適于水體或土壤污染的植物修復(fù)材料提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 對照組材料

本試驗選用三種李氏禾材料：采自桂林市桃花江邊的李氏禾（材料1）；采自桂林某電鍍廠廢水排污口生長的李氏禾，對鉻有極強的耐性（材料2）；利用植物組織培養(yǎng)法對材料2進(jìn)行了擴(kuò)繁的后代（材料3）。2008年4月選取長勢良好的三種材料移栽于無污染的栽培池中，為對照組，每種材料各100株，次年取材測定。

1.1.2 處理組材料

將另一栽培池的四周及底部鋪上一層塑料薄膜，模擬電鍍廠廢水排污環(huán)境，配制K2Cr2O7溶液（20 mg·L-1），與栽培土壤均勻混合后放入池中。2008年8月上旬將上述三種材料各50株移栽至池中作為處理組，使其終年生長于其中。每組對應(yīng)的材料分別為材料4、材料5和材料6，定期澆灌配置好的K2Cr2O7溶液，使栽培土中Cr6+盡量保持一定濃度不變。次年取材測定。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理及各種生理指標(biāo)測定

2009年10月上旬，分別取上述六種材料（各取15株）的葉片，摘取時間上午8∶00～9∶00，去離子水沖洗3次，然后105℃下殺青30 min，80℃烘干4 h，分裝后于4℃冰箱保存，用于以下測定：丙酮法測定葉綠素含量[10]，DNS（3，5-二硝基水楊酸法）比色法測定還原糖含量[10]，巴比妥酸（Barbituric acid，TBA）顯色法測定丙二醛（Malonaldehyde，MDA）含量[10]，三氯化鋁顯色法測定類黃酮含量[11]。

2009年10月上旬，分別取上述六種材料（各取15株）的葉片，摘取時間上午8∶00～9∶00，去離子水沖洗3次后，加入適量預(yù)冷的磷酸緩沖液（pH 7.8，含有1%聚乙烯吡咯烷酮）及少量石英砂于冰浴上勻漿，在4℃下離心20 min，取上清液用于以下測定：茚三酮顯色法測定脯氨酸含量[10]，考馬斯亮藍(lán)G250法測定可溶性蛋白含量[10]，氮藍(lán)四唑（Nitrogen blue tetrazolium，NBT）顯色法測超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性[10]，愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（Peroxidase，POD）活性[10]，紫外吸收法測定過氧化氫酶（Catalase，CAT）活性[10]。

1.2.2 SDS-PAGE電泳

2009年10月上旬，分別取上述六種材料的葉片，各取0.5 g，摘取時間上午8：00～9：00，用去離子水沖洗3次后，加入3 mL預(yù)冷的蛋白提取液（pH 8.0，含有1%聚乙烯吡咯烷酮和Tris-HCl緩沖液）及少量石英砂于冰浴上勻漿，靜置2 h后，于4℃下離心20 min，取上清液2 mL用于SDS-PAGE電泳。分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%。上樣量均為25 μL，在室溫下進(jìn)行電泳。上述試驗均為3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，材料之間用t-檢驗法進(jìn)行比較，P＜0.05被認(rèn)為有顯著差異；反之為不顯著。成對比較組別有相同環(huán)境下，材料2與1的比較；材料2與3的比較；材料5與4的比較，材料5與6的比較；不同環(huán)境中，材料1與4的比較，材料2與5的比較，材料3與6的比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉻污染對李氏禾葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量的影響

重金屬毒害植物的一個重要特征就是引起葉綠素減少、蛋白質(zhì)含量降低，從而使植物失綠，產(chǎn)生毒害現(xiàn)象[12]。處理組材料的葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素和類胡蘿卜素含量均顯著低于（P＜0.05）對照組的相應(yīng)材料，說明土壤中過多的Cr6+已經(jīng)在李氏禾體內(nèi)產(chǎn)生一定的毒害作用，Cr6+可能與葉綠體中蛋白質(zhì)上的巰基結(jié)合或取代其中的Fe2+、Zn2+和Mg2+，破壞了葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能[13]，從而使植物葉片內(nèi)葉綠素含量有所降低（見表1）。

其次，無論是對照組還是處理組，葉綠素總量是材料1、2、3或4、5、6呈逐漸升高的趨勢；同時材料3的含量高于材料2、材料6高于材料5，差異顯著（P＜0.05）。這很可能是因為材料2在放入無污染的栽培土之前，長期生長在鉻污染的環(huán)境中，從而產(chǎn)生了某些耐性機制從而減少了Cr對葉綠素的傷害；在處理組中生長的材料6繼承了材料3的這一特性。由此可見，葉綠素含量有穩(wěn)定遺傳的傾向。

2.2 鉻污染對李氏禾葉片還原糖、丙二醛和類黃酮含量的影響

表1 鉻脅迫下李氏禾葉片葉綠素及類胡蘿卜素含量的變化Table 1 Change of chlorophyll and carotenoid content in leaves of Leersia hexandra under Cr stress

表2 鉻脅迫下李氏禾葉片還原糖、丙二醛和類黃酮的含量的變化Table 2 Change of reducing sugars,MDA,and flavonoid content in leaves of Leersia hexandra under Cr stress(mg·g-1)

由表2可知，在處理組中生長的3個材料，其還原糖、MDA及類黃酮的含量均高于對照組的3個材料，差異較顯著（P＜0.05）。

植物葉內(nèi)可溶性糖含量代表碳水化合物的運轉(zhuǎn)情況，亦可以作為生理指標(biāo)之一來反映重金屬污染對作物的毒害作用[14]。處理組3個材料葉片的還原糖含量均高于對照組，差異較顯著（P＜0.05）（見表2）。說明一定濃度的鉻脅迫下可促進(jìn)李氏禾葉片內(nèi)可溶性糖的合成。植物在逆境中，細(xì)胞原生質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸會發(fā)生過氧化作用產(chǎn)生MDA，因而MDA含量可反映膜脂過氧化作用的強弱[15]。處理組3個材料葉片的MDA積累均顯著高于對照組（P＜0.05）（見表2），可能是處于一定鉻濃度脅迫下，體內(nèi)產(chǎn)生并積累大量活性氧引發(fā)了膜脂過氧化。

處理組3個材料葉片的類黃酮化合物均顯著高于對照組（P＜0.05）（見表2）。類黃酮化合物是植物體內(nèi)重要的次生代謝物，一些體外實驗也證明，類黃酮物質(zhì)具有很高的抗氧化活性，具體表現(xiàn)為減少自由基的產(chǎn)生和清除自由基兩個方面，其在植物適應(yīng)逆境過程中發(fā)揮重要的作用[16]。

2.3 鉻污染對李氏禾葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量的影響

脯氨酸是一種較理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，其在抗逆中的作用是作為滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[17]，來保持原生質(zhì)與環(huán)境的滲透平衡，防止水分散失，逆境下可用作反映植物抗逆性的參考性生理指標(biāo)[18]。在抗逆中脯氨酸還有保持膜結(jié)構(gòu)的完整性的作用[19]，如果植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受阻，會抑制脯氨酸摻入蛋白質(zhì)而造成脯氨酸的大量積累[20]。處理組的3個材料，其葉片的脯氨酸含量均顯著低于對照組（P＜0.05）；而可溶性蛋白含量均顯著高于對照組（P＜0.05）（見表3），說明在一定鉻濃度的脅迫下3個材料體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成受到一定程度的刺激。

表3 鉻脅迫下李氏禾葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量的變化Table 3 Change of proline and soluble protein content in leaves of Leersia hexandra under Cr stress

2.4 鉻污染對李氏禾葉片SOD、POD和CAT活性的影響

由表4可知，處理組3個材料的SOD和POD酶活性顯著低于對照組（P＜0.05）；而CAT酶活性則顯著高于對照組（P＜0.05）。說明一定鉻濃度的脅迫下，李氏禾體內(nèi)多種功能膜及酶系統(tǒng)均受到一定程度的破壞，造成SOD及POD活性有所下降；但其體內(nèi)的CAT活性受到一定的刺激作用而有所的增加，可清除細(xì)胞內(nèi)過量的H2O2，使植物能適應(yīng)鉻的污染。

圖1 鉻脅迫下李氏禾葉片的SDS-PAGE電泳Fig.1 SDS-PAGE in leaves of Leersia hexandra under Cr stress

由圖1可知，3個材料在對照組和處理組中無表達(dá)差異的蛋白條帶出現(xiàn)，且分子質(zhì)量為64.6、52.5、47.7和30.2 ku的多肽在圖譜中的表達(dá)量較明顯。說明一定濃度的鉻脅迫對李氏禾的蛋白組分沒有明顯影響；但處理組的蛋白條帶亮度明顯比對照組強，與表3中的可溶性蛋白含量的增加相一致。

3 討論

葉綠體是植物細(xì)胞所特有的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，它受重金屬的影響也比較明顯[9]，且葉綠素減少、蛋白質(zhì)含量降低是植物受到重金屬毒害一個重要特征。本試驗發(fā)現(xiàn)，與正常環(huán)境相比，在一定濃度的鉻脅迫下，李氏禾體內(nèi)葉綠素含量的減少，這是由于其葉綠體的結(jié)構(gòu)和功能均受到一定程度的破壞，從而使植物體內(nèi)葉綠素含量有所降低。但通過比較兩種環(huán)境下可溶性蛋白含量的差異，發(fā)現(xiàn)在一定鉻濃度脅迫下李氏禾體內(nèi)蛋白質(zhì)含量有所增加，可能水溶性蛋白質(zhì)與鉻以某種形式結(jié)合進(jìn)而降低了鉻對細(xì)胞的傷害；而脯氨酸含量則有所降低，可能由于部分脯氨酸參與了水溶性蛋白質(zhì)的合成，說明李氏禾為適應(yīng)在鉻污染環(huán)境下生長而進(jìn)行了一些生理調(diào)節(jié)。

在鉻污染環(huán)境中生長的三種材料，其還原糖、MDA及類黃酮的含量均高于在對照組正常環(huán)境生長的三種材料，其原因為李氏禾體內(nèi)鉻過多的積累，不僅破壞了其體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的平衡，造成MDA的大量積累，而且過多的自由基，刺激其體內(nèi)產(chǎn)生了大量的類黃酮化合物，以達(dá)到抑制產(chǎn)生自由基過多的目的。

植物體內(nèi)活性氧自由基的危害集中體現(xiàn)于其對膜脂的過氧化作用，造成膜脫脂并引起膜滲漏。眾多研究證明POD、SOD和CAT是植物體內(nèi)酶促防御系統(tǒng)的3個重要保護(hù)酶，彼此協(xié)同起來可以解除細(xì)胞內(nèi)有害的自由基[21]，保護(hù)植物細(xì)胞免受活性氧的損傷。SOD是超氧自由基清除劑，在逆境脅迫下，當(dāng)植株體內(nèi)超氧自由基的增加超過正常歧化能力的極限時，會對組織細(xì)胞多種功能膜及酶系統(tǒng)造成破壞，使SOD活性急劇或緩慢下降[12]；POD在清除植物體內(nèi)產(chǎn)生的有毒物質(zhì)中有重要意義[22-23]，可用來鑒別環(huán)境污染對植物的毒害[24]；CAT能夠清除細(xì)胞內(nèi)過多的H2O2，使細(xì)胞內(nèi)H2O2維持在一個正常水平，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[25]。在一定鉻濃度污染環(huán)境中，三種材料的SOD和POD活性有所下降，CAT有所增強，說明其體內(nèi)多種功能膜及酶系統(tǒng)均受到一定程度的破壞，但是CAT活性的增強可一定程度上阻止破壞的繼續(xù)，并協(xié)同SOD和POD解除細(xì)胞內(nèi)有害的自由基，在一定程度上使李氏禾適應(yīng)鉻污染的環(huán)境。

SDS-PAGE分析顯示，兩種環(huán)境下三種材料均無差異蛋白條帶出現(xiàn)，說明一定鉻濃度脅迫下，李氏禾體內(nèi)的蛋白組分未受到影響而發(fā)生改變。

4 結(jié)論

李氏禾在一定鉻濃度脅迫的環(huán)境中其葉片的葉綠素、可溶性糖、MDA、類黃酮化合物、脯氨酸、可溶性蛋白含量和保護(hù)酶SOD、POD、CAT活性能適應(yīng)鉻脅迫并作出相應(yīng)的調(diào)節(jié)，從而維持植株良好生長。鉻耐性的組培后代李氏禾（材料3、6）在兩種環(huán)境中的各項生理指標(biāo)較鉻耐性材料（材料2、5）均有較顯著的提高。李氏禾可以作為一種具潛力的環(huán)境修復(fù)植物。

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