李麗莉 楊蕾 陳保文 都偉欣 盧錦標(biāo) 白東亭 王國治

2011年7月20日，WHO公布的一項政策建議中指出：使用目前市面上商業(yè)性血液（血清學(xué)）檢測手段診斷活動性結(jié)核病，常常導(dǎo)致誤診和不當(dāng)治療，進而損害公眾健康。WHO敦促各國采用其推薦的準(zhǔn)確的微生物或分子檢測方法，禁止使用不準(zhǔn)確的和未經(jīng)批準(zhǔn)的血清學(xué)檢測方法［1］。該報告中還稱：大量證據(jù)表明，與WHO推薦的檢測方法相比，血清學(xué)檢測產(chǎn)生大量假陽性或假陰性的錯誤結(jié)果［1］。

WHO公布的“關(guān)于活動性結(jié)核病檢測手段”的政策建議，引起國家食品藥品監(jiān)督管理局（SFDA）以及SFDA相關(guān)部門的高度重視，2012年4月16日，SFDA發(fā)布了《關(guān)于進一步加強結(jié)核病血液檢測試劑監(jiān)管有關(guān)事宜的通知》（食藥監(jiān)辦械［2012］48號），要求各省、自治區(qū)、直轄市食品藥品監(jiān)督管理局按照通知要求對行政區(qū)域內(nèi)有關(guān)結(jié)核病血液檢測試劑的注冊審評情況開展檢查，試圖通過對國內(nèi)生產(chǎn)結(jié)核病診斷血清學(xué)制品的企業(yè)進行一次背景調(diào)查，分析目前國內(nèi)結(jié)核病血清學(xué)檢測試劑在生產(chǎn)過程質(zhì)量控制和在臨床評價中存在的問題及解決問題的方法。

一、我國目前結(jié)核病血清學(xué)檢測試劑的使用情況分析

（一）我國結(jié)核病血清學(xué)檢測試劑現(xiàn)狀

在我國結(jié)核病臨床實驗室檢測技術(shù)中，血清學(xué)檢測是結(jié)核病輔助診斷的重要診斷試劑之一。市場上銷售的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑有近百家，經(jīng)國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的國產(chǎn)診斷制品抗體檢測試劑盒29個，其中經(jīng)國家級批準(zhǔn)的26個，省級批準(zhǔn)的3個；進口制品1個?？乖瓩z測試劑盒3個，其中省級批準(zhǔn)的1個。大多數(shù)未經(jīng)批準(zhǔn)的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑游離于國家監(jiān)管范圍之外，值得引起國家有關(guān)部門及人員的關(guān)注與重視。

（二）結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑生產(chǎn)企業(yè)背景調(diào)查情況介紹

本次調(diào)研根據(jù)國家食品藥品監(jiān)督管理局的通知要求，對行政區(qū)域內(nèi)有關(guān)結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑的注冊審評情況開展檢查，并組織行政區(qū)域內(nèi)有關(guān)生產(chǎn)企業(yè)按照要求填報相關(guān)資料。調(diào)查資料的內(nèi)容主要包括試劑盒背景資料，試劑盒成品檢測，試劑盒檢測參考品制備與標(biāo)化，參考品使用情況及臨床研究等方面。通過對各生產(chǎn)企業(yè)報送的資料進行分析，共收回調(diào)查問卷29份。我國目前結(jié)核病血清學(xué)診斷制品的品種與近3年的數(shù)量見表1。由于無法掌握未經(jīng)批準(zhǔn)的結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑的非法銷售情況，表1結(jié)果并不能代表國內(nèi)實際銷售狀況。

表1 我國結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑近3年產(chǎn)量分析

二、結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑存在的問題和建議

（一）陽性參考品的選擇

多數(shù)企業(yè)在陽性參考品選擇時通常只選擇菌陽患者抗體強陽性血清，如果試劑某批次質(zhì)量出現(xiàn)問題，敏感度偏低時，若陽性參考品中全部使用強陽性血清，所有陽性參考品反應(yīng)均呈陽性，則無法反映該試劑的真實敏感度，如標(biāo)準(zhǔn)品中有弱陽性血清的反應(yīng)可能呈陰性，提示試劑敏感度可能存在問題。因此，血清學(xué)抗體檢測試劑在質(zhì)量控制中需要強、中、弱三種不同效價的血清用于敏感度的質(zhì)量控制。同理，在試劑制備過程出現(xiàn)問題，可能產(chǎn)生假陽性時，如果陰性參考血清都選擇本底極低的樣品，可能無法檢出，因此陰性參考品應(yīng)含有臨界陰性參考血清［2］。

（二）參考品的標(biāo)化

為獲得陽性與陰性不同效價的血清，獲得血清后應(yīng)先進行初篩，再用不同的方法學(xué)對血清進行效價標(biāo)定，確定血清的效價，從中選擇不同反應(yīng)強度的樣本，作為陽性或陰性參考品。但多數(shù)企業(yè)未進行細致的效價標(biāo)化，通常以試劑盒篩選后就作為檢測參考品。

同時，標(biāo)準(zhǔn)品的建立應(yīng)有規(guī)范的操作細則，至少樣品采集、檢測與標(biāo)化的過程中所有的實驗操作均需先制定標(biāo)準(zhǔn)操作方法（standard operating procedure，SOP），再嚴(yán)格遵循SOP進行操作，并有對應(yīng)的原始記錄。目前，從已收到的資料來看，多數(shù)企業(yè)存在不足之處。

（三）參考品的制備

結(jié)核病體外診斷試劑參考品通常由陽性參考品、陰性參考品、最低檢出量或最低檢出限參考品和精密性或重復(fù)性參考品組成，用來控制試劑盒的敏感度、特異度、檢出限和精密度等。但部分試劑廠家僅有陽性與陰性檢測參考品［3］。

由于參考品用于體外診斷試劑質(zhì)量控制，所以參考物質(zhì)原料的選擇取決于診斷試劑的預(yù)期用途。原料應(yīng)與試劑盒的使用要求相一致或盡可能接近，這樣可以消除方法基體效應(yīng)引入的系統(tǒng)誤差［2］，陽性參考品應(yīng)包括痰菌陰性和痰菌陽性患者的血清，但個別企業(yè)僅采用采血站篩選的抗體陽性血清作為陽性參考品。

（四）參考品的穩(wěn)定性

參考物質(zhì)的均一性和穩(wěn)定性：均一性可保證一批原料所制備的參考品均勻一致，即在不同空間檢測結(jié)果的一致性和可比性；穩(wěn)定性可使一批參考品長期分發(fā)使用，為企業(yè)或科研院所提供用于質(zhì)量評價的參考品，保證在不同時間檢測結(jié)果的一致性和可比性。穩(wěn)定性考察一般需要觀察在不同溫度下放置不同時間，或經(jīng)過反復(fù)凍融后，觀察效價降低的情況。通過測定不同溫度，不同凍融次數(shù)時特征活性的降低速率，從而確定貯存的適宜溫度和時間，或反復(fù)凍融的次數(shù)。

（五）參考品制備與檢測的安全性

血液（抗體、抗原和γ－干擾素）檢測試劑盒的參考物質(zhì)主要來源于感染者或疑似感染者的血液樣本，另外，對于以人為來源的生物材料作為參考品原料或輔料，因其具有傳染性，一定要注意實驗室安全性［4］。

三、臨床研究方面存在的問題與建議

（一）敏感度與特異度虛高

WHO評估結(jié)果顯示，市售不同廠家的血液（血清學(xué)）診斷試劑的敏感度和特異度變化很大，敏感度變化范圍為0%～100%，特異度變化范圍為31%～100%［1］。根據(jù)收集的各企業(yè)臨床資料顯示：我國血液診斷試劑的敏感度平均值為80%左右，高于70%的占79%；特異度平均值為92%，高于90%的占95%。我國試劑調(diào)查結(jié)果與WHO的評估結(jié)果相比，我國試劑敏感度和特異度變化范圍較小，而且變化范圍相對集中。根據(jù)多年來我國結(jié)核病血清學(xué)抗體檢測試劑質(zhì)量評價的經(jīng)驗，目前的血清學(xué)抗體檢測試劑，由于抗原種類和檢測方法的原因，敏感度和特異度不可能同時達到很高的水平。事實上，該類產(chǎn)品若要達到高的敏感度，就必然會犧牲一定的特異度；特異度高，則必然以犧牲一部分敏感度為前提。但在此次調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，為數(shù)不少的產(chǎn)品臨床研究得到的敏感度和特異度均超過了90%（敏感度和特異度均在90%以上的產(chǎn)品比例為26%），超出了筆者對該方法學(xué)的認識，這些數(shù)據(jù)的真實性存在疑問，其產(chǎn)生的原因可能是臨床研究與數(shù)據(jù)處理不夠嚴(yán)謹(jǐn)，造成統(tǒng)計結(jié)果的偏差。因為提交資料的廠家均未提供詳細的臨床研究資料，所以還需進行進一步的調(diào)研。

（二）臨床評價僅采用與同類制品進行比較評價的缺陷

部分企業(yè)根據(jù)《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》［5］，“已有同品種批準(zhǔn)上市”產(chǎn)品的臨床研究可采用已批準(zhǔn)上市、質(zhì)量較好的產(chǎn)品作為對比試劑，進行對比試驗研究。只用兩種同類試劑進行比較，兩種方法的檢測結(jié)果不一致率可能較低。但若將血清學(xué)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)進行比較，則可能會出現(xiàn)兩種血清學(xué)檢測結(jié)果均與金標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不一致率高的現(xiàn)象。即只用同類制品進行對比試驗，無法體現(xiàn)臨床陽性檢出的真實情況［4］。

實際《體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中對“新診斷試劑產(chǎn)品”和“已有同品種批準(zhǔn)上市”產(chǎn)品的臨床研究的研究對象選擇的規(guī)定原則相同，即：“研究對象應(yīng)包括兩組：一組是用金標(biāo)準(zhǔn)確定為有某種疾病的患者組，另一組是用金標(biāo)準(zhǔn)證實無該病的患者或正常人群，作為對照組”。根據(jù)這一要求，臨床研究無論采取哪種方式進行，都要求收集所有入選者臨床診斷的數(shù)據(jù)。

（三）臨床研究的規(guī)范性

對此次調(diào)查收集到的臨床研究進行分析發(fā)現(xiàn)，多數(shù)未規(guī)范進行臨床研究，不能隨機入選客觀評價，數(shù)據(jù)經(jīng)處理修改痕跡明顯，這是導(dǎo)致臨床研究的特異度與敏感度不真實的主要因素。因此，應(yīng)建立規(guī)范的評價方法，臨床研究內(nèi)容與過程應(yīng)盡可能與試劑臨床使用一致，建議：（1）疑似結(jié)核病患者隨機入組，依據(jù)《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288－2008）》［7］將入選者分為結(jié)核病患者組（臨床診斷患者與確診患者）計算敏感度，非結(jié)核病對照組計算特異度［7］。（2）細菌學(xué)實驗室檢查陽性檢出結(jié)果分析。結(jié)核病患者組檢出結(jié)果分析：培養(yǎng)陽性樣本的陽性總檢出率分析包括：痰涂片和培養(yǎng)均為陽性（涂陽培陽），以及痰涂片陰性和培養(yǎng)陽性（涂陰培陽），所有陽性樣本合起來（涂陽培陽、涂陰培陽樣本）計算陽性檢出率分析。培養(yǎng)陰性樣本的陰性總檢出率分析包括：痰涂片和培養(yǎng)均為陰性（涂陰培陰），以及痰涂片陽性和培養(yǎng)陰性（涂陽培陰），所有陰性樣本（涂陰培陰、涂陽培陰）合起來計算陰性檢出率分析。（3）與同類制品檢測結(jié)果比較分析。必要時可與同類制品進行符合率比較，二者不一致時依據(jù)《肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)（WS288－2008）》［7］要求的評價標(biāo)準(zhǔn)（或其他適宜方法或試劑）判斷各樣本檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

四、小結(jié)

（1）血清學(xué)檢測試劑不能作為結(jié)核病確診方法，但是可作為結(jié)核病的輔助診斷手段，我國結(jié)核病菌陰患者占70%以上［8］，結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑作為菌陰肺結(jié)核的輔助診斷手段之一依然有存在必要。（2）試劑盒質(zhì)量應(yīng)嚴(yán)格控制，進一步完善產(chǎn)品質(zhì)量控制，對質(zhì)量不好的產(chǎn)品，應(yīng)進行整改。（3）客觀的臨床評價是質(zhì)量考核的重要依據(jù)，建議制定結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑臨床評價指南，在有可能的情況下，對上市產(chǎn)品進行臨床評估，擇優(yōu)推廣。（4）對于非法銷售的產(chǎn)品，因其質(zhì)量無法控制，應(yīng)予以取締。

［1］World Health Organization.World Health Organization（2011）policy statement：commercial serodiagnostic tests for diagnosis of tuberculosis.Geneva：WHO，2011.

［2］中國生物制品標(biāo)準(zhǔn)化委員會.中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)（2000年版）.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

［3］陳保文，都偉欣，王國治，等.結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑生產(chǎn)質(zhì)量控制與臨床研究概述.中國防癆雜志，2012，34（8）：546－549.

［4］中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.北京：中國教育出版社，2006：8－45.

［5］中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局.體外診斷試劑臨床研究技術(shù)指導(dǎo)原則.北京：中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局，2007：3.

［6］中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局.體外診斷試劑注冊管理辦法（試行）.北京：中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理局，2007：2.

［7］中華人民共和國衛(wèi)生部.WS288－2008肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn).北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：2－3.

［8］全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查技術(shù)指導(dǎo)組，全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查辦公室.2010年全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查報告.中國防癆雜志，2012，34（8）：485－508.