王海燕，朱希強(qiáng)，郭學(xué)平

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院，山東 濟(jì)南 250101)

結(jié)冷膠在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用

王海燕1，2，朱希強(qiáng)2，郭學(xué)平1，2

(1.山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012;2.山東省生物藥物研究院，山東 濟(jì)南 250101)

結(jié)冷膠作為一種安全無(wú)毒的食品添加劑，由于其自身的優(yōu)良特性，使之在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究與應(yīng)用不斷擴(kuò)大，近年來(lái)突出表現(xiàn)在藥劑學(xué)和組織工程方面。本文重點(diǎn)綜述了結(jié)冷膠在這兩方面的研究與應(yīng)用。

結(jié)冷膠;藥劑學(xué);組織工程

結(jié)冷膠(gellan gum)是一種由革蘭陰性好氧桿菌——少動(dòng)鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas paucimobilis)產(chǎn)生的陰離子型線型胞外多糖［1］。結(jié)冷膠最早由美國(guó)Kelco公司從水百合中分離所得，1988年在日本被批準(zhǔn)用于食品，1992年被美國(guó)FDA批準(zhǔn)為食品添加劑，我國(guó)于1996年批準(zhǔn)結(jié)冷膠為食品增稠劑、穩(wěn)定劑［2］。

結(jié)冷膠具有高度的分散性和廣泛的復(fù)配性，形成的溶液透明度高，有顯著的溫度滯后性和熔點(diǎn)可調(diào)性;結(jié)冷膠形成的凝膠能夠耐酸、耐高溫，還能抵抗微生物及酶的作用［3］。結(jié)冷膠集增稠、懸浮、乳化等功能于一體，在食品中主要用于糖果、果醬和果凍、人造食品、水基凝膠、飲料乳品、寵物食品等［4］。近年來(lái)隨著研究的深入，結(jié)冷膠在食品以外領(lǐng)域的應(yīng)用不斷擴(kuò)大。本文對(duì)其在醫(yī)藥領(lǐng)域的研究與應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 結(jié)構(gòu)與膠凝機(jī)制

1.1 結(jié)構(gòu)

結(jié)冷膠的相對(duì)分子質(zhì)量高達(dá)(2～3)×105，分子主鏈由重復(fù)的四糖單元組成，參與形成四糖單元的單糖依次為β(1→3)－D－葡萄糖、β(1→4)－D－葡萄糖醛酸、β(1→4)－D－葡萄糖、α(1→4)－L－鼠李糖。天然結(jié)冷膠每個(gè)重復(fù)單元中的β(1→3)－D－葡萄糖2位都連有1個(gè)O－甘油?；?，6位每隔1個(gè)單位連有1個(gè)O－乙?；?，又稱為高?；Y(jié)冷膠。高?；Y(jié)冷膠經(jīng)堿熱處理，可以使分子上的酰基部分或全部脫除成為低?；Y(jié)冷膠［5］。高?；Y(jié)冷膠中的酰基在分子聚集成膠時(shí)會(huì)產(chǎn)生阻礙作用，形成柔軟有彈性的凝膠，低?；Y(jié)冷膠則形成結(jié)實(shí)脆性高的凝膠［6］。此外，高酰基結(jié)冷膠含有的?；谒嵝詶l件下容易水解不穩(wěn)定，因此工業(yè)中更常用低酰基結(jié)冷膠。

美國(guó)Kelco公司是全球最大的結(jié)冷膠生產(chǎn)商，它有3種?；坎煌?不含?；⒌王；⒏啧；?的產(chǎn)品，對(duì)應(yīng)的商品名為:Gelrite ? 、Kelcogel? F、Kelcogel? LT100。Gelrite? 可用于嗜熱細(xì)菌的培養(yǎng)和植物組織培養(yǎng);Kelcogel?是用量最多的食品級(jí)結(jié)冷膠，廣泛用于食品和個(gè)人洗護(hù)用品。Kelcogel?LT100用量相對(duì)較少，主要用于飲料生產(chǎn)。市場(chǎng)上的還有Sigma公司推出的商品名為Phytagel?的結(jié)冷膠，主要用于微生物污染的檢測(cè)和植物組織培養(yǎng)。

1.2 膠凝機(jī)制

將結(jié)冷膠粉末均勻分散在冷水中，通過(guò)加熱煮沸或80℃水浴0.5 h，都可形成均一透明的溶液。結(jié)冷膠溶液在高溫時(shí)，分子呈分散的無(wú)規(guī)則線團(tuán)狀，隨著溫度的降低，相鄰的分子會(huì)相互纏繞形成雙螺旋二聚體，繼續(xù)降低溫度，溶液中無(wú)規(guī)則分散的雙螺旋長(zhǎng)鏈間會(huì)以反向平行的方式聚集成分子束，未形成分子束的雙螺旋長(zhǎng)鏈，會(huì)與分子束交叉連接形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生膠凝作用［7］。

在實(shí)際應(yīng)用中，要制備結(jié)構(gòu)穩(wěn)固的結(jié)冷膠凝膠，需要在冷卻過(guò)程中加入少量陽(yáng)離子。因?yàn)榻Y(jié)冷膠羧基側(cè)鏈間存在靜電排斥作用，能阻礙雙螺旋的聚集，導(dǎo)致低濃度的結(jié)冷膠溶液在冷卻過(guò)程中，因聚集體數(shù)量不足而不能成膠，陽(yáng)離子的引入則能夠屏蔽靜電排斥作用［8］。結(jié)冷膠對(duì)二價(jià)陽(yáng)離子尤為敏感，達(dá)到相同凝膠強(qiáng)度所需的一價(jià)陽(yáng)離子濃度大約是二價(jià)離子的25倍［9］。因?yàn)橐粌r(jià)陽(yáng)離子主要通過(guò)屏蔽羧基間的靜電排斥作用促進(jìn)結(jié)冷膠成膠，二價(jià)離子除了靜電屏蔽外還能直接與兩個(gè)羧基形成化學(xué)鍵，從而強(qiáng)烈地促進(jìn)分子聚集成膠［10］。結(jié)冷膠的陽(yáng)離子敏感特性是它在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的基礎(chǔ)。

2 在藥劑學(xué)中的應(yīng)用

結(jié)冷膠安全無(wú)毒的特性是它在藥劑中應(yīng)用的前提，陽(yáng)離子敏感特性使它可用于制備原位凝膠，還可用作緩控釋制劑的載體、膠囊的囊材、片劑的黏合劑等。

2.1 眼用制劑

Gelrite?作為藥用輔料被廣泛用于眼用制劑，最具代表性的是Merck公司上市的用于治療青光眼的噻嗎洛爾長(zhǎng)效眼用制劑Blocarden? Depot(Timoptic XE?)。它以低黏度溶液狀對(duì)眼角膜給藥，溶液中的結(jié)冷膠遇到淚液中的陽(yáng)離子可迅速形成原位凝膠。研究表明該制劑較普通的噻嗎洛爾滴眼液在兔眼部的生物利用度增加3～4倍，在人體的給藥頻率可從每天2次減少為每?jī)商?次［11－12］。

Carlfors等［13］對(duì)結(jié)冷膠在眼中形成的原位凝膠進(jìn)行流變學(xué)研究，認(rèn)為溶液在眼中形成凝膠的彈性模量取決于結(jié)冷膠的濃度，凝膠可在角膜上滯留達(dá)20 h，其滯留時(shí)間與結(jié)冷膠濃度(0.4% ～1.0%)無(wú)關(guān)。Paulsson 等［14］指出淚液中含量最多的Na+是引發(fā)結(jié)冷膠成膠的主要離子，0.5% ～1%的結(jié)冷膠溶液形成凝膠所需的離子量為淚液中離子量的10%～25%，結(jié)冷膠濃度稀釋為0.1%仍可在眼中形成凝膠。

以結(jié)冷膠為輔料制備的離子敏感型眼用制劑，不僅增加了滴眼液在眼內(nèi)的滯留時(shí)間提高了生物利用度，而且形成的凝膠使藥物很難流到鼻淚管中，減少了藥物流入鼻腔所致的不良反應(yīng)。

2.2 鼻用制劑

人的鼻黏膜內(nèi)充滿組織液(約0.1 mL)，可以與滴注到鼻腔內(nèi)的結(jié)冷膠溶液充分接觸形成原位凝膠，延長(zhǎng)藥物與鼻腔內(nèi)吸收部位的接觸時(shí)間，使藥物緩慢持續(xù)的釋放，尤其適用于需長(zhǎng)期給藥的藥物［15］。

Jansson等［16］以熒光素標(biāo)記的葡聚糖為示蹤劑，考察了大鼠鼻黏膜上皮細(xì)胞對(duì)以結(jié)冷膠為載體的鼻用制劑的吸收分布情況。研究表明，結(jié)冷膠溶液與大鼠鼻黏膜接觸后立即形成原位凝膠，可在鼻腔內(nèi)存留4 h以上。與甘露醇溶液相比，結(jié)冷膠能更好地促進(jìn)鼻黏膜上皮細(xì)胞對(duì)葡聚糖的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)，且未觀察到不良反應(yīng)。

Cao等［17］以結(jié)冷膠作為輔料制成糠酸莫米松鼻用制劑，通過(guò)鼻內(nèi)滴注給藥觀察對(duì)大鼠過(guò)敏性鼻炎的療效。研究表明，該制劑在(40±2)℃下放置6個(gè)月性質(zhì)穩(wěn)定不變，每只大鼠按20μg/d的劑量連續(xù)鼻內(nèi)給藥1個(gè)月對(duì)鼻黏膜無(wú)任何刺激，與同劑量的糠酸莫米松普通液體制劑相比療效顯著提高。

以結(jié)冷膠為載體的鼻用制劑不僅克服了溶液劑在鼻黏膜表面滯留時(shí)間短，生物利用度較低的缺陷，而且克服了一些鼻用生物黏附劑黏度過(guò)高使用不便、給藥量不準(zhǔn)的缺點(diǎn)。

2.3 口服制劑

結(jié)冷膠作為藥物包埋材料，水化后形成的凝膠屏障對(duì)藥物起到緩釋作用。Alhaique等［18］最早將結(jié)冷膠作為軟膠囊的囊材用于藥物緩釋研究，對(duì)不同環(huán)境下藥物含量不同的膠囊進(jìn)行溶出度測(cè)定，表明藥物與淀粉的質(zhì)量比越低藥物溶出度越高，說(shuō)明膠囊對(duì)溶劑的吸收度可能是影響藥物緩釋機(jī)制的主要因素。Agnihotri等［19］采用離子凝膠法制備頭孢菌素IV的結(jié)冷膠球形粒子，通過(guò)對(duì)制劑的各種參數(shù)進(jìn)行考察表明，該球形粒子的平均直徑在925～1 183μm，藥物包埋率達(dá)69.24%，在 0.1 mol/L HCl溶液或 pH 7.4 磷酸鹽緩沖液中，藥物釋放速率沒(méi)明顯區(qū)別，釋藥時(shí)間都達(dá)6 h，藥物擴(kuò)散過(guò)程稍微偏離Fickian擴(kuò)散模型。研究還指出Ca2+和Zn2+聯(lián)用可使結(jié)冷膠凝膠的孔徑更均一，緩釋效果更明顯。

Miyazaki等［20］將茶堿溶于1%的含有少量枸櫞酸鈉絡(luò)合物的結(jié)冷膠溶液，添加Ca2+制得茶堿口服緩釋制劑。研究表明該制劑在胃部酸性環(huán)境中能釋放出游離Ca2+，使結(jié)冷膠很快形成原位凝膠而產(chǎn)生緩釋作用，與市售的相同濃度的茶堿緩釋制劑相比，在大鼠體內(nèi)的生物利用度增加了4～5倍，在兔體內(nèi)的生物利用度增加了3倍，但平均滯留時(shí)間無(wú)顯著改變。

Emeje等［21］將結(jié)冷膠作為甲硝唑片劑的輔料，研究表明該片劑在模擬胃液中和模擬腸液中的溶脹都是一級(jí)動(dòng)力學(xué)，與溶出介質(zhì)的酸堿度無(wú)關(guān)，但溶出的速率與范圍依賴于介質(zhì)的酸堿度，片劑在模擬腸液中比在模擬胃液中溶脹快，溶出速率高。結(jié)冷膠制成的片劑屬于親水型凝膠緩釋片，是一種水溶蝕性釋藥骨架，水溶性和難溶性藥物都可通過(guò)結(jié)冷膠凝膠層起到緩釋效果。

3 在組織工程方面的應(yīng)用

結(jié)冷膠作為一種生物材料用于醫(yī)學(xué)組織工程，主要是作為細(xì)胞移植的載體。若將細(xì)胞直接移植到組織面，并不能立即聚集成立體組織結(jié)構(gòu)，需要體外載體來(lái)維持細(xì)胞的生存促進(jìn)組織再生。結(jié)冷膠水凝膠含水豐富，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞和細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，在組織工程中現(xiàn)已成熟應(yīng)用的多糖水凝膠有瓊脂糖、透明質(zhì)酸、殼聚糖等［22］。用作細(xì)胞移植載體的結(jié)冷膠，有商用的未經(jīng)過(guò)修飾的，也有經(jīng)氧化降解或化學(xué)交聯(lián)進(jìn)行修飾的。

3.1 未經(jīng)修飾的結(jié)冷膠

Smith等［23］最早提出將結(jié)冷膠用作組織工程材料，他們將大鼠骨髓細(xì)胞固定在αMEM培養(yǎng)基與1%Gelrite?形成的水凝膠中，體外培養(yǎng)21 d細(xì)胞存活且無(wú)細(xì)胞毒性，認(rèn)為結(jié)冷膠有作為組織工程支架的潛能。Oliveira等［24－26］將結(jié)冷膠作為軟骨細(xì)胞移植的載體進(jìn)行了相關(guān)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞進(jìn)行包埋后切成薄片植入裸鼠皮下，觀察4周，各種指標(biāo)表明結(jié)冷膠能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)和胞外基質(zhì)分泌，說(shuō)明結(jié)冷膠是軟骨細(xì)胞移植的優(yōu)良載體。Oliveira等［27］還以結(jié)冷膠作為人自體同源的脂肪干細(xì)胞的載體，觀察治療兔關(guān)節(jié)軟骨損傷的可行性。結(jié)果表明脂肪干細(xì)胞形成的軟骨組織良好，可能用于治療關(guān)節(jié)軟骨損傷，克服目前臨床中分離軟骨細(xì)胞前需要進(jìn)行組織檢查的缺陷。

上述研究表明結(jié)冷膠是細(xì)胞移植的優(yōu)良載體，但因結(jié)冷膠膠凝點(diǎn)較高，都是在體外成膠后將凝膠薄片植入體內(nèi)，仍存在植入操作上的不便。

3.2 經(jīng)過(guò)修飾的結(jié)冷膠

商品用的未經(jīng)過(guò)修飾的結(jié)冷膠在1.5%濃度時(shí)膠凝點(diǎn)在42℃以上，若有離子存在膠凝點(diǎn)會(huì)更高。所以要保持2%左右的膠濃度并滿足注射的要求，就必須降低結(jié)冷膠的膠凝點(diǎn)，使它在生理溫度37.5℃時(shí)能夠懸浮哺乳動(dòng)物細(xì)胞，注射到缺陷部位后再通過(guò)降溫等方式形成凝膠。

3.2.1 氧化降解 有研究表明，將結(jié)冷膠進(jìn)行NaIO4氧化和Smith降解，可以降低相對(duì)分子質(zhì)量，從而降低膠凝點(diǎn)［28］。用降解后的產(chǎn)物來(lái)包埋豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)150 d的體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)降解后的結(jié)冷膠比瓊脂糖更能促進(jìn)細(xì)胞增殖和胞外基質(zhì)分泌。Fan等［29］用Phytagel?氧化降解后的產(chǎn)物包埋兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)42 d結(jié)果表明，結(jié)冷膠與兔滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞形成的凝膠經(jīng)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子 β1、β3(TGF－β1、TGF－β3)和 成骨蛋白－2(BMP－2)處理后，在體外能夠很好的促進(jìn)軟骨組織再生，滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞有可能用來(lái)治療軟骨損傷。

經(jīng)過(guò)氧化降解的結(jié)冷膠，膠凝點(diǎn)大大降低，可以滿足常溫注射的要求，但降解后的產(chǎn)物凝膠性能是否改變，需要進(jìn)一步的體內(nèi)試驗(yàn)來(lái)考察。

3.2.2 化學(xué)交聯(lián) Coutinho等［30］認(rèn)為不同組織的再生速率不同，對(duì)組織材料的力學(xué)要求也不同，通過(guò)物理方法(加入Ca2+并降溫)形成的結(jié)冷膠凝膠，在生理?xiàng)l件下Ca2+會(huì)被Na+、K+置換，凝膠強(qiáng)度逐漸減弱，需要對(duì)結(jié)冷膠進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)來(lái)增加凝膠強(qiáng)度，形成力學(xué)特性和降解速率可調(diào)的水凝膠以滿足不同組織的要求。以甲基丙烯酸酐為交聯(lián)劑，改變交聯(lián)劑用量可產(chǎn)生不同取代度的異丁烯酸結(jié)冷膠，形成的水凝膠楊氏模量在0.15～148 kPa間變化。用交聯(lián)產(chǎn)物包埋人體成纖維細(xì)胞，體外培養(yǎng)7 d后觀察細(xì)胞存活率較高，說(shuō)明交聯(lián)后的結(jié)冷膠有較好的組織相容性，有在組織工程領(lǐng)域應(yīng)用的可能。

4 展望

結(jié)冷膠卓越的膠凝性能和離子敏感特性，使它近年來(lái)在醫(yī)藥領(lǐng)域受到了很大關(guān)注，突出表現(xiàn)在藥劑學(xué)和組織工程方面。Lee等［31］最新報(bào)道將結(jié)冷膠交聯(lián)形成薄膜材料用于外科手術(shù)中的傷口止血，表明結(jié)冷膠止血作用明顯并能促進(jìn)膠原蛋白再生。此外，Silva等［32］將結(jié)冷膠用于骨髓支架材料的開(kāi)發(fā)，表明該復(fù)合材料具有良好的生物相容性，有望用于臨床中骨髓損傷后的修復(fù)再生。然而結(jié)冷膠相對(duì)低的發(fā)酵產(chǎn)量及下游產(chǎn)物處理過(guò)程費(fèi)用較大，限制了它的經(jīng)濟(jì)適用性。目前有研究通過(guò)基因工程的手段提高結(jié)冷膠產(chǎn)量，同時(shí)對(duì)結(jié)冷膠的純化過(guò)程進(jìn)行改進(jìn)。相信隨著結(jié)冷膠的產(chǎn)量增加和純度提高，結(jié)冷膠在醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)?huì)有更廣闊的應(yīng)用。

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Application of gellan gum in medicine and pharmacy

WANG Hai－yan1，2，ZHU Xi－qiang2，GUO Xue－ping1，2
(1.School of Pharmaceutical Science，Shandong University，Jinan 250012，China;2.Institute of Biopharmaceuticals of Shandong Province，Jinan 250101，China)

TQ460.6

A

1005－1678(2012)02－0192－04

2011－02－22

王海燕，女，碩士研究生，制藥工程學(xué)專業(yè);郭學(xué)平，男，通信作者，研究員，碩士生導(dǎo)師，Tel:0531－82685555，E－mail:guoxp@fredabiopharm.com.cn。