范曉寧

深圳南山區(qū)人民醫(yī)藥感染科，廣東深圳 518052

目前在我國，慢性乙型肝炎已經(jīng)成為了一種臨床常見傳染性病癥。慢性乙型肝炎會(huì)引起肝衰竭、肝硬化以及原發(fā)性肝細(xì)胞癌等并發(fā)癥，給患者及其家屬帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失和心理負(fù)擔(dān)，同時(shí)也給社會(huì)帶來一定的影響[1]。在現(xiàn)階段對(duì)慢性乙型肝炎進(jìn)行治療的方法主要有抗病毒、抗纖維化、抗炎保肝、免疫調(diào)節(jié)以及對(duì)癥治療等幾種方式，在這眾多方法中抗病毒是對(duì)慢性乙型肝炎進(jìn)行治療的重中之重。目前國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的可以用來對(duì)慢性乙型肝炎患者進(jìn)行抗病毒治療的藥物主要有干擾素和核苷酸類似物這兩大類，干擾素類主要包括有普通IFNα-2b與聚乙二醇化IFNα-2a/2b;核苷(酸)類似物主要包括拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋以及替比夫定等。HBV是DNA病毒的一種，其自然史需要?dú)v經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的一個(gè)階段，然而逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)3,-5，外切酶相對(duì)比較缺乏，因此會(huì)使HBV很容易發(fā)生突變，所以在患者的體內(nèi)其實(shí)病毒是以準(zhǔn)種的形式存在[2]。在本次研究中，處于對(duì)HBV核苷類似物耐多藥的檢測(cè)進(jìn)行分析的目的，我們抽取在過去一段時(shí)間在我院就診的患有慢性乙型肝炎發(fā)生多藥耐藥的患者病例的臨床治療資料進(jìn)行分析。以下為本次研究的結(jié)果報(bào)道。

1 資料與方法

1.1 一般資料

隨機(jī)抽取在2005～2011年這對(duì)時(shí)間內(nèi)在我院就診慢性乙型肝炎患者發(fā)生多藥耐藥的病例18例，在所抽取的患者中有男性患者11例以及有女性患者7例，所有患者的年齡均在26～67歲之間，患者的平均年齡在44歲左右，以上所統(tǒng)計(jì)的患者的所有自然資料均不具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可以在分析中予以應(yīng)用。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

患者接受拉米夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋以及替比夫定等單獨(dú)用藥或者是聯(lián)合用藥進(jìn)行治療，并且存在治療失敗的情況，主要有發(fā)生了病毒學(xué)的突破或者是在進(jìn)行治療的48周后HBV DNA依舊比檢測(cè)下限的患者要高，對(duì)依從性差等原因予以排除，自愿對(duì)詳細(xì)病史資料予以提供并且通過病毒耐藥檢測(cè)被診斷為是多藥耐藥[3]。

1.3 方法

對(duì)所抽取的18例患者中采用克隆測(cè)序法在每位患者體內(nèi)隨機(jī)篩選60個(gè)克隆，對(duì)菌液聚合酶鏈反應(yīng)以及經(jīng)酶切進(jìn)行鑒定結(jié)果為陽性的單克隆予以測(cè)序，并對(duì)患者出院3個(gè)月后進(jìn)行隨訪，對(duì)患者的基因型以及耐藥基因變異的模式進(jìn)行分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

在本次研究過程中所得到的所有相關(guān)數(shù)據(jù)，均采用SPSS 14.0統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理分析，當(dāng)P＜0.05時(shí)，我們認(rèn)為數(shù)據(jù)之間有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

對(duì)這18例患者出院后3個(gè)月進(jìn)行隨訪，11例男性患者中HBeAg均呈現(xiàn)為陽性結(jié)果，7例女性患者的HBeAg均呈現(xiàn)陰性。在這其中被診斷為乙肝后肝硬化和肝細(xì)胞癌的患者有5例，被診斷為乙肝后肝硬化的患者有5例，其他的8例患者均被診斷為慢性乙型肝炎。在這18例患者中的所有標(biāo)本的巢式PCR擴(kuò)增均呈現(xiàn)陽性結(jié)果，陰性對(duì)照沒有發(fā)生擴(kuò)增。

3 討論

作為強(qiáng)且有效的抗HBV藥物,核昔(酸)類似物目前正面臨著HBV耐藥性所產(chǎn)生的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。正如過去的研究結(jié)果所說的那樣,現(xiàn)階段的核昔(酸)類似物不會(huì)對(duì)細(xì)胞核內(nèi)的cccDNA產(chǎn)生較好的效果,所以在停藥之后病毒的載量會(huì)出現(xiàn)反彈的現(xiàn)象,因此一般情況下應(yīng)對(duì)患者進(jìn)行較長時(shí)間的藥物治療。但是,用藥時(shí)間過長會(huì)對(duì)耐藥突變株的選擇產(chǎn)生影響。拉米夫定作為第一個(gè)獲得FDA批準(zhǔn)的一個(gè)對(duì)HBV進(jìn)行治療的藥物，其剛開始的耐藥率大約為20%左右,而后幾年時(shí)間里其耐藥率則呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢(shì)，約上升到40%～70%左右,已經(jīng)對(duì)長期使用拉米夫定產(chǎn)生了嚴(yán)重的威脅。到目前為止,任何已經(jīng)上市或者是即將投入使用的核昔(酸)類似物均存在不同程度的耐藥現(xiàn)象[4]。對(duì)于一些結(jié)構(gòu)相似，且具有作用機(jī)制的相同的藥物之間也會(huì)存在交叉耐藥性,這使原本就嚴(yán)峻的耐藥問題更加雪上加霜。但是值得安慰的是,阿德福韋作為第二個(gè)被FDA予以批準(zhǔn)的抗HBV核昔(酸)類似物，其耐藥性不是十分的顯著,并且不會(huì)和拉米夫定產(chǎn)生嚴(yán)重的交叉性耐藥性；恩替卡韋作為第三個(gè)獲的批準(zhǔn)的核苷類似物其耐藥性也相對(duì)比較輕微,但是還需要對(duì)其予以長期的臨床觀察。最近一段時(shí)間有文獻(xiàn)曾報(bào)道說阿德福韋或者是恩替卡韋是在拉米夫定產(chǎn)生耐藥的基礎(chǔ)上產(chǎn)生治療效果的,阿德福韋或恩替卡韋發(fā)生耐藥的比率要比沒有采用拉米夫定進(jìn)行治療的患者多很多[5]。

HBV對(duì)核苷類似物的耐藥機(jī)制主要為以下幾點(diǎn)：HBV聚合酶所涉及的功能范圍主要為:末端蛋白，參與引發(fā)逆轉(zhuǎn)錄的過程；間隔蛋白、逆轉(zhuǎn)錄酶以及RNaseH。而逆轉(zhuǎn)錄酶的主要功能域有A-G這7個(gè)結(jié)構(gòu)域[6]。目前對(duì)HBV聚合酶氨基酸序列進(jìn)行編號(hào)采用的是曾經(jīng)有相關(guān)學(xué)者所提出的分別對(duì)4個(gè)功能域進(jìn)行編號(hào)的方法。以下的全部氨基酸序號(hào)都對(duì)這一編號(hào)方法予以了合理的例用。HBV逆轉(zhuǎn)錄酶C域203-206位氨基酸會(huì)形成具有保守性的YMDD基序，與一些其它的對(duì)RNA產(chǎn)生依賴的聚合酶相同,都是居于酶催化活性中心的一個(gè)主要的組成部分。雖然很難對(duì)HBV聚合酶進(jìn)行純化從而獲得晶體的衍射結(jié)構(gòu),然而由于HBV以及HIV等的逆轉(zhuǎn)錄酶表現(xiàn)出比較明顯的序列同源性關(guān)系,目前已有很多研究小組根據(jù)HIV聚合酶對(duì)HBV聚合酶的三維結(jié)構(gòu)模型予以了模擬構(gòu)建。HBV聚合酶也具有“右手構(gòu)象”的特點(diǎn),同樣是由“拇指”、“掌”以及“手指”這三個(gè)亞功能域所組成的。在“掌”部，“手指”以及新加人的dNTP上其催化活性位點(diǎn)會(huì)與模板發(fā)生作用?！澳粗浮钡闹饕饔镁褪菍?duì)模板的定位和鏈的延伸進(jìn)行參與。dNTP結(jié)合位點(diǎn)又被稱作是dNTP作結(jié)合口袋，存在于“掌”與“手指”之間[7]。

產(chǎn)生HBV耐藥性發(fā)生突變的主要原因是：任何對(duì)RNA產(chǎn)生依賴的聚合酶均不具有顯著的校正功能,也就是指3，-5，外切酶的活性。因此與依賴DNA的聚合酶相比其具有很高的錯(cuò)配率。在HBV進(jìn)行復(fù)制的周期過程中,對(duì)依賴RNA的聚合酶予以了兩次的使用:第一次是存在于宿主細(xì)胞的RNA聚合酶Ⅱ自cccDNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄而得到前基因組RNA；第二次是HBV的逆轉(zhuǎn)錄酶通過前基因組RNA逆轉(zhuǎn)錄對(duì)基因組DNA進(jìn)行合成。因此,盡管HBV屬于DNA的病毒,但是其發(fā)生突變的概率與其它的DNA病毒性比要高很多。HBV的突變率為在每個(gè)復(fù)制循環(huán)過程中，每個(gè)堿基會(huì)有10-4的機(jī)會(huì)，針對(duì)于每毫升的血清病毒載量為1012的病毒粒子的患者而言,HBV的復(fù)制率會(huì)達(dá)到每天1012病毒粒子。對(duì)這些理論數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得知，一個(gè)患者的體內(nèi)所含的HBV每天幾乎會(huì)發(fā)生1000次點(diǎn)的突變。HBV的基因組相對(duì)較小，僅為3.2Kb左右，其所具有的ORF均會(huì)與其他的ORF發(fā)生重疊。因此，往往1個(gè)點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致多個(gè)基因產(chǎn)物也隨之發(fā)生變化[8]。所以，具有高突變率的HBV所引起的大部分的突變體對(duì)病毒來說都是有害的，但是只是一部分而已，還是會(huì)有一部分的突變是有利的，或者說在某種選擇壓力下是有意義的。相當(dāng)大的一部分耐藥準(zhǔn)種所具有的復(fù)制能力要比野生型的低很多，因此在不存在藥物選擇壓力的條件下，耐藥準(zhǔn)種的含量相當(dāng)?shù)纳?。但在?duì)核昔(酸)類似物予以應(yīng)用以后，很快耐藥的HBV準(zhǔn)種就將其它準(zhǔn)種超過了從而占據(jù)了統(tǒng)治的地位。在停藥以后，該統(tǒng)治地位又會(huì)重新被野生型所取代。

綜上所述，作為抗HBV藥物核昔(酸)類似物具有一定的治療效果，它們?nèi)詫⒃谝欢〞r(shí)期內(nèi)成為對(duì)HBV感染進(jìn)行治療的一個(gè)首選藥物。由于人們已經(jīng)比較深入的了解了抗HBV核昔(酸)類藥在臨床的應(yīng)用過程中所產(chǎn)生的耐藥性的機(jī)制與規(guī)律，也許能夠通過對(duì)不同患者的HBV基因型以及表型進(jìn)行監(jiān)測(cè)從而制定出比較獨(dú)特的抗病毒的治療方案，進(jìn)而使核昔(酸)類藥所具有的抗HBV治療作用能夠得到更好地發(fā)揮。

[1]林向飛,林秀英，韓清錫.拉米夫定對(duì)慢性乙型肝炎肝硬化患者的療效觀察[J].中華肝臟病雜志，2009,10(14)：304-306.

[2]金榮華，郎振為，姚光弼，慢性乙型肝炎患者拉米夫定治療后肝組織學(xué)的改變[J].中華肝臟病雜志，2008,11(29):555-557.

[3]譚小燕，胡世云.拉米夫定抗慢性乙型肝炎后肝纖維化的療效[J].中華肝臟病雜志，2009,11(12):753-754.

[4]Bartho lomew M M，JansenRW.Jeffers L J.Hepatitis infection after ortho topic liver transp lantaton[J].Lancet,2007，349(9044)：120.

[5]王克霞,王健,張榮波.HBV血清學(xué)標(biāo)志物與PCR HBV DNA檢測(cè)結(jié)果的比較[J].錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,20(14):232-233.

[6]王健,黃桂珍.聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)慢性乙型肝炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞內(nèi)和血清中HBV DNA[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2008,33(13):212-213.

[7]蔡衛(wèi)平,唐小平,陳勁峰,等.慢性乙型肝炎HBV DNA定量檢測(cè)與病原標(biāo)記和肝損害程度的關(guān)系[J].中國實(shí)用內(nèi)科雜志,2008,18(13):149-150.

[8]徐風(fēng),陳惠蘭,嚴(yán)斌,等.肺結(jié)核合并HBV感染患者血清HBV-DNA的檢測(cè)及其意義[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2009,18(14):211-212.