鹿理友 于傳亭 辛志玲

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)展迅速，侵襲性強(qiáng)，惡性程度高，預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。雖然手術(shù)技術(shù)的提高，治療有了很大的提高，但發(fā)現(xiàn)時(shí)往往已至晚期，手術(shù)效果不理想?；虮磉_(dá)水平的改變是細(xì)胞癌變的一個(gè)重要因素。近幾年發(fā)現(xiàn)和發(fā)展起來的RNA干擾技術(shù)，是一種新興基因阻斷技術(shù)，同源性mRNA的降解通過內(nèi)外源性雙鏈RNA觸發(fā)，從而使該基因表達(dá)沉默。人體正常組織及細(xì)胞中有STATs少許表達(dá)，正常的生理功能得以維持。但持續(xù)性的激活在腫瘤組織及細(xì)胞中卻表現(xiàn)出來[2]，被認(rèn)為是潛在的腫瘤抑制因子。其中以sTAT3尤為活躍，現(xiàn)多認(rèn)為其可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡[3]。本研究觀察stat3-siRNA表達(dá)質(zhì)粒在治療AFP陽性腫瘤基因中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 RPMI 1640培養(yǎng)基購自Invitro-gen公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Qiagen公司;轉(zhuǎn)染試劑購自大連寶生物公司;電脈沖儀為德國ECM 630;電擊杯購自Bio-Rad生物公司;細(xì)胞總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司);反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-p01ymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒購自TAKARA公司;人肝癌細(xì)胞株HepG2為本室保存。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 常規(guī)方法接種于1640新鮮培養(yǎng)基復(fù)蘇的肝癌細(xì)胞株 HepG2，于37℃，5%的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，含10%小牛血清，含均100 U/ml雙抗青霉素、鏈霉素，G418濃度為400ug/ml，傳代培養(yǎng)用0.25%的胰蛋白酶消化，觀察是否為細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，備實(shí)驗(yàn)用。

1.2.2 質(zhì)粒DNA的擴(kuò)增與抽提 由上海生物工程技術(shù)有限公司合成的長(zhǎng)度為350 bpPCR產(chǎn)物，引物序列如下:βactin sense: 5'GCACCACACCTTCTACAATG 3'; antisense:5'GTGGTGAAGCTGTAGC3'。根據(jù)美國國立衛(wèi)生圖書館基因庫中人STAT 3 mRNA序列(NM 31500)合成其引物序列如下:mstAT 3 sense:5'CAGccTcTCTGCAGAATTCAA3';antisense:5'AGCCCATGTGATCTGACACC 3'，取 100 μl感受態(tài)細(xì)胞，待轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA50ng加入，輕輕混勻后30 min冰浴，熱休克42℃90 s后，立刻2 min冰浴，LB 培養(yǎng)基900 μl加入，搖床振蕩，45 min培養(yǎng)。離心5 min以4℃4000 r/min，大部分上清棄去，僅200 μl培養(yǎng)基留下，菌體輕輕莆懸，在50 μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂糖平板上將其涂布，37℃培養(yǎng)過夜，接種陽性菌落于4ml LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩過夜。質(zhì)粒抽提采用美國Qiagen公司小提質(zhì)粒試劑盒，嚴(yán)格依照說明書步驟提取。

1.2.3 RNA的提取 按試劑說明書完成RT-PCR收獲的細(xì)胞，取總RNA10 μg逆轉(zhuǎn)錄為cDNA以紫外分光光度計(jì)法定量后進(jìn)行，PCR條件:94℃，5 min;94℃，30 s;56℃，30 s;72℃，45 s;72℃，7 min，30循環(huán)，25 μL體系，PCR 產(chǎn)物以20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為內(nèi)參，EB染色，圖像分析應(yīng)用天能Gis凝膠成像系統(tǒng)，以光密度/面積表示PCR產(chǎn)物量，最終結(jié)果以STAT3產(chǎn)物量/b-actin產(chǎn)物量的比值，3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)，引物序列:引物均由上海生工公司合成，B-actin:Sense5'-AAGTACTCCGTGTGGATCGG-3'， Antisence5'-ATGCTATCACCTCCCCTGTG-3';STAT3:Sense5'-TTGCCAGTTGTGGTGATC-3'，Antisence 5'-AGACCCAGAAGGAGCCGC-3'。

1.2.4 Western blot方法檢測(cè) 收集空白組、陰性對(duì)照組、siRNA組細(xì)胞。離心制備的單細(xì)胞懸液，上清液棄去，PBS沖洗，50 μl預(yù)冷的細(xì)胞裂解液加入，30 min冰浴中裂解，離心20 min已4℃、12000r/min，取上清，-70℃保存待測(cè)。測(cè)定蛋白含量應(yīng)用Bradford比色法。樣品電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，在SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后。置PVDF膜于5%脫脂奶粉溶液中。4℃封閉過夜。加入兔抗人，濃度為1∶500～1∶1000，1.5～2 h抗孵育。TBST洗膜后加入羊抗兔二抗1∶5000孵育。lh孵育，Lurriglo Keageut試劑A、B液洗膜后加入，反應(yīng)15～30 min。X光片暴光，拍照。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)緩沖液中加入轉(zhuǎn)染后的肝癌細(xì)胞，按Immuno-tech公司的說明書進(jìn)行，用冰PBS液洗2次1×106個(gè)/ml細(xì)胞，細(xì)胞濃度調(diào)整為1×106個(gè)/ml，于490 μL細(xì)胞懸液中加入5 μl Annexin V液(1∶10稀釋)和5ul碘化丙錠(250μg/ml，冰浴放置10min，轉(zhuǎn)染48h后的細(xì)胞1×106個(gè)分別收集，離心，細(xì)胞用冷PBS懸浮，離心10min以1000 r/min，清洗2遍，棄上清，用1ml注射器將細(xì)胞快速推入700ml/L冷乙醇中，4℃固定12 h以上，PBS洗2次，細(xì)胞密度調(diào)整為1×109/L，用RNase消化后，1.5ml PI50 mg/L加入對(duì)DNA進(jìn)行染色，混勻后單參數(shù)分析上流式細(xì)胞儀FCM做，各期細(xì)胞所占比例根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用累積曲線分割法計(jì)算，實(shí)驗(yàn)共重復(fù)3次，用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示。多組均數(shù)間的顯著性檢驗(yàn)用方差分析，兩組均數(shù)間的比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 stat3 mRNA的表達(dá)量比較 經(jīng)比較，stat3相對(duì)量在空白組和陰性對(duì)照組無明顯差異，siRNA組的stat3相對(duì)量比空白組和陰性對(duì)照組明顯減少(P＜0.01)，見表1。

表1 stat3 mRNA的表達(dá)量比較

2.2 凋亡率與G1期阻滯率的比較 流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染stat3-siRNA的細(xì)胞與陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組比較在G1期出現(xiàn)明顯阻滯，在 G1期出現(xiàn)的阻滯為(78.17±21.73)%，凋亡率達(dá)(21.39±9.47)%，與空白組和陰性對(duì)照組比較有明顯差異(P＜0.01)，見表2。

表2 凋亡率與G1期阻滯率的比較

3 討論

世界范圍內(nèi)原發(fā)性肝癌是發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，新患此病的患者每年約有100萬以上，肝癌發(fā)患者數(shù)中國居世界首位，每年死于肝癌約23萬人，占全球肝癌患者死亡數(shù)的53%，列惡性腫瘤病死率第2位，雖有進(jìn)展的綜合性治療手段，但令人滿意的療效仍不能取得[4]。到目前尚未清楚肝癌的確切發(fā)病機(jī)制，但可以肯定其形成是一個(gè)多因素、多階段、多步驟、多系統(tǒng)、多基因參與的復(fù)雜過程，一些信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的異?？赡苌婕暗?，進(jìn)而異常的激活一系列原癌基因以及失活導(dǎo)致的抑癌基因突變。

近年來興起的RNAi技術(shù)，分子生物治療中為異常表達(dá)stat3腫瘤開辟了新的途徑，與傳統(tǒng)的基因治療方法相比RNAi具有兩大明顯優(yōu)勢(shì)，高特異性和高抑制率，與之序列同源的mRNA能夠被siRNA非常特異地誘導(dǎo)降解，而無關(guān)基因不受影響;且其表達(dá)抑制基因的效率極高，甚至基因表達(dá)可完全阻斷，效果接近基因敲除技術(shù)。siRNA是21-23bp小片段雙鏈RNA，可以和靶基因mRNA序列特異性互補(bǔ)結(jié)合，誘導(dǎo)其降解，RNA干擾效應(yīng)產(chǎn)生強(qiáng)大[5]。近年siRNA成功轉(zhuǎn)入活體內(nèi)的進(jìn)展，使得siRNA藥物被人們?cè)絹碓狡诖艹蔀榫Τ渑娴摹澳g(shù)子彈”，應(yīng)用于病毒感染、寄生蟲感染、人類腫瘤等的治療[6]。siRNA可以特異性地作用于信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及肝癌的相關(guān)基因，可望提供標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)為肝癌的診斷和治療[7]。與蛋白相比，在細(xì)胞能耗方面非編碼RNA作為調(diào)控分子存在優(yōu)勢(shì)，因?yàn)槠洳恍枰g，能量消耗更少，而且比蛋白更容易降解[8]。

Stat3是一類脫氧核糖核酸結(jié)合蛋白，有少量表達(dá)在細(xì)胞漿內(nèi)，其在細(xì)胞核內(nèi)無表達(dá)，是轉(zhuǎn)錄激活因子家族與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要成員之一。Stat3信號(hào)傳導(dǎo)通路接受多種非受體酪氨酸激酶、G蛋白、細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子等分子刺激，通過借助細(xì)胞內(nèi)的一類具有激酶結(jié)構(gòu)的連接蛋白JAKs磷酸化而被激活從而完成信息轉(zhuǎn)導(dǎo)。設(shè)想癌細(xì)胞內(nèi)stat3基因的表達(dá)如能設(shè)法阻斷，癌細(xì)胞增殖能力定會(huì)大大減弱，同時(shí)減弱凋亡抑制[9]。Gao等[10]設(shè)計(jì)人喉部鱗狀細(xì)胞癌Hep2細(xì)胞轉(zhuǎn)染兩對(duì)STAT3-siRNA，研究結(jié)果顯示在未經(jīng)處理的Hep2細(xì)胞和空質(zhì)粒對(duì)照的Hep2細(xì)胞中STAT3被表達(dá)，而STAT3的表達(dá)在siRNA-sTAT3轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中明顯減少，且表現(xiàn)為時(shí)間和劑量依賴性。

RNAi技術(shù)可以使特定基因的表達(dá)在mRNA水平抑制。而一種簡(jiǎn)單有效的RNAi實(shí)現(xiàn)方法是通過化學(xué)合成、細(xì)胞內(nèi)表達(dá)siRNA。本研究中，我們成功地合成了siRNA轉(zhuǎn)染肝癌HepG2細(xì)胞后。實(shí)現(xiàn)了有效抑制STAT3的基因表達(dá)，與空白組和陰性對(duì)照組均有明顯差異(P＜0.01)。充分顯示了該技術(shù)抑制基因表達(dá)特異、高效、簡(jiǎn)便快捷的優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用Western blot證實(shí)stat3在人肝癌細(xì)胞的過度表達(dá)由于siRNA而明顯抑制，隨著stat3表達(dá)抑制，癌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，本研究顯示siRNA組的凋亡率明顯比空白組和陰性對(duì)照組增高(P＜0.01)。我們認(rèn)為，以sTAT3為靶點(diǎn)的siRNA技術(shù)有望成為肝癌基因治療的新途徑。

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