楊 軍，莫新民△，李勁平

(1．湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410007;2．中南大學(xué)，長沙 410208)

壯骨止痛方治療大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松癥的蛋白質(zhì)組學(xué)分析*

楊 軍1，莫新民1△，李勁平2

(1．湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙 410007;2．中南大學(xué)，長沙 410208)

目的:探討壯骨止痛方治療骨質(zhì)疏松相關(guān)蛋白改變譜。方法:利用二維凝膠電泳分離股骨組織的總蛋白，通過軟件分析2-DE圖譜，比較各組間蛋白的表達(dá)量，然后利用MALDI-TOF-MS制作差異蛋白點(diǎn)的肽譜，確定各差異蛋白的種類，通過生物信息學(xué)分析所得蛋白的功能。結(jié)果:壯骨止痛方能調(diào)節(jié)骨骼肌的能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)大鼠去卵巢骨質(zhì)疏松癥產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。

壯骨止痛方;蛋白質(zhì)組學(xué);骨質(zhì)疏松癥

△通訊作者:莫新民，男，教授，博士研究生導(dǎo)師，湖南長沙市雨花區(qū)韶山中路113號(hào)湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生院。

骨質(zhì)疏松癥(OP)是以骨量減少，骨小梁變細(xì)、斷裂、數(shù)量減少，皮質(zhì)骨多孔、變薄等骨的微觀結(jié)構(gòu)退化為特征，以致骨的脆性增高及骨折危險(xiǎn)性增高的一種全身性骨?。?］，多發(fā)生在絕經(jīng)后婦女、老人和多種慢性疾病患者。雌激素在西醫(yī)臨床治療該病中為主要用藥之一。壯骨止痛方是根據(jù)中醫(yī)傳統(tǒng)醫(yī)理，在臨床治療該病療效顯著的方藥，為探明其治療途徑以及微觀機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)采用蛋白組學(xué)方法，從分子生物學(xué)角度研究該方的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1．1 材料和試劑

1．1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí) 30只 3月齡雌性SD大鼠，體重250g±10g左右，由湖南省中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào) SCXK(湘)2009-0004)，購進(jìn)大鼠后在湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)。

1．1．2 試劑 丙烯酰胺、甲雙叉丙烯酰胺、Tris-base、SDS、巰 基 乙 醇、Triton x-100、Urea、TEMED、過硫酸氨和考馬斯亮藍(lán)G-250等購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，兩性載體電解質(zhì)和甘氨酸購自北京經(jīng)科試劑公司，三氟乙酸(TFA)為日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社產(chǎn)品，碘乙酰胺購自Sigma公司，乙氰(CAN)為國產(chǎn)色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1．1．3 壯骨止痛方藥液 壯骨止痛方全方提取液(由中南大學(xué)藥學(xué)院按標(biāo)準(zhǔn)流程提取)，灌胃時(shí)全方藥物為油相和水相混合物。

1．1．4 主要設(shè)備 基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)(MALDI-TOF-MS)為美國Applied Biosystems公司產(chǎn)品，圓盤電泳槽和高壓穩(wěn)壓穩(wěn)流電源(北京六一儀器廠產(chǎn)品)、普通臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、低溫高速離心機(jī)(Beckman公司)。

1．2 動(dòng)物造模

SPF級(jí)SD雌性大鼠購進(jìn)后在動(dòng)物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)3d～5d，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和壯骨止痛方組。術(shù)前常規(guī)用 2%戊巴比妥鈉(0．2mL/100g)麻醉動(dòng)物，模型組動(dòng)物切除雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組僅進(jìn)行手術(shù)操作，只切除部分脂肪但保留卵巢，術(shù)后各組動(dòng)物用青霉素抗炎治療7d;壯骨止痛方組在消炎7d后開始灌胃(劑量為0．6ml水相 +0．4ml油相/100g)，假手術(shù)組和模型組則每天用等量生理鹽水灌胃1次，共灌胃13周。

1．3 大鼠股骨組織蛋白樣品的提取和處理

實(shí)驗(yàn)大鼠在最后1次灌胃后禁食24h，用2%的戊巴比妥鈉(0．2mL/100g)腹腔注射，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術(shù)架上，用碘伏消毒手術(shù)部位，手術(shù)剪剪開腹腔后采集標(biāo)本，取大鼠左后肢股骨剔除附著的肌肉筋膜，保留骨膜，生理鹽水沖洗后，將骨放入同一陶瓷研缽中進(jìn)行液氮研磨至粉末狀。取0．5g粉末加入 1ml樣品提取緩沖液，充分混勻，4℃12000g離心 10min，去除不溶性顆粒，取上清液200μl，以1∶10比例加入樣品提取緩沖液，置水浴10min以消化核酸，超聲處理5min進(jìn)一步裂解核酸，加入終濃度為 80%，4℃預(yù)冷丙酮，4℃靜置10min，12000g離心 10min棄上清，用 200ul樣品提取緩沖液重新溶解沉淀，吸取上清液即為提取的組織總蛋白質(zhì)，移至一干凈的 Eppendrof管中保存至－80℃?zhèn)溆?。另?μl上清液用2D Quant Kit蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。

1．4 雙向電泳

用pH8-10的兩性電解質(zhì)配制IEF膠條。第一向預(yù)電泳 200V 30min、300V 30min、400V 2h，上樣后電壓400V 12h后調(diào)到 600V 6h。另外，用 12．5%SDS-PAGE凝膠上端使IPG膠條與凝膠上端緊密貼合，在一端加入凝膠電泳蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品，排盡氣泡后，用含痕量溴酚藍(lán)0．5%的瓊脂糖封頂，待瓊脂糖冷卻凝固后裝入 Ettan DALT垂直電泳槽中。設(shè)置Ettan DALT電泳條件為:每膠 2．0(2．5)W 電泳30min后再以每膠10(12)W恒功率電泳，直至溴酚藍(lán)指示線到達(dá)凝膠底邊處1cm處停止電泳。第二向電泳總時(shí)間約需用6h左右，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍(lán) G-250染色。使用 ImageScanner 2D Platinum 6．0圖像分析軟件，對(duì)凝膠進(jìn)行系統(tǒng)掃描做圖像分析。

1．5 質(zhì)譜樣品的制備

比較3組雙向電泳圖譜，找到差異蛋白，從膠上切下，切成 1mm3大小置于 0．5ml的 Eppendorf管中，先后進(jìn)行脫色、酶解、萃取、脫鹽、低溫真空離心等處理后，與 HCCA基質(zhì)混勻，取2μL點(diǎn)于樣品靶上室溫干燥，插入質(zhì)譜儀的樣品室中打譜。

1．6 質(zhì)譜分析

質(zhì)譜樣品使用美國基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)MALDI-TOF-MS進(jìn)行分析，采用反射模式，離子源加速電壓1為20000V，加速電壓2為23000V，N2激光波長337nm，脈沖寬度3ns，離子延遲2000nsec，真空度4×10－7pa，質(zhì)譜信號(hào)單次掃描累加50次，用標(biāo)準(zhǔn)Marker峰作為外標(biāo)校正質(zhì)譜峰，正離子譜測(cè)定獲得肽質(zhì)量指紋圖譜。

1．7 數(shù)據(jù)庫的查詢

通過 Matrixscience公司網(wǎng)站提供的Mascotwizard軟件進(jìn)行，具體按照 http∥www．matrix science．com/cgi/search．fromselecthtml進(jìn) 行 查 詢。查詢條件:分子量、等電點(diǎn)未作限定，肽片斷分子量的誤差范圍100ppm，未水解的酶位點(diǎn)數(shù)為1，蛋白種屬選擇大鼠，Mass values選擇為 MH+，選擇Monoisotopic，固定修飾選擇為Carbamidomethyl(C)，可變修飾不選。

2 結(jié)果

2．1 卵巢切除術(shù)后骨質(zhì)疏松模型造模成功的檢查

通過骨密度、生物力學(xué)、病理學(xué)檢測(cè)顯示，模型組和假手術(shù)組相比較，腰椎骨密度明顯下降，骨小梁稀疏、破壞，髓腔擴(kuò)大，骨梁髓比明顯下降，右脛所能承受的最大壓力下降，說明大鼠去卵巢后不僅有骨量的減少，還有骨強(qiáng)度的下降，這些特征與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的生理改變類似，說明本實(shí)驗(yàn)中的病理模型復(fù)制成功。

2．2 大鼠骨組織蛋白雙向電泳圖譜的比較

圖1 大鼠股骨組織蛋白雙向電泳各組圖譜的比較

圖1顯示，3張圖譜非常相似，蛋白點(diǎn)主要集在pI5-7和Mw 10～100KD區(qū)域。從整個(gè)圖譜分析，肉眼可辨別大約320多個(gè)蛋白點(diǎn)，且蛋白點(diǎn)之間區(qū)分比較清晰，可以對(duì)其進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的差異分析。對(duì)模型組、全方組、假手術(shù)組股骨組織蛋白雙向電泳圖譜比較，共發(fā)現(xiàn)32個(gè)明顯差異蛋白，其中重點(diǎn)選擇了3個(gè)差異蛋白進(jìn)行分析，分別命名為Px1、Px2、Px3，其分子量依次約為43kD、79kD、44kD。表1顯示，采用雙向電泳圖譜分析軟件(Ge-nomic So1utions Investigator HT Analyzer version 2．02)對(duì)差異蛋白的相對(duì)含量進(jìn)行分析。

表1 大鼠股骨組織蛋白雙向電泳圖譜差異蛋白在各組的相對(duì)含量比較

2．3 MALDI-TOF-MS肽質(zhì)量指紋圖譜分析

對(duì)3個(gè)差異蛋白進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析，得到各自的肽質(zhì)量指紋圖譜。圖2顯示，3個(gè)肽質(zhì)量指紋圖譜信號(hào)較強(qiáng)，基線平穩(wěn)，適合進(jìn)一步數(shù)據(jù)庫檢索鑒定。根據(jù)得到的肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)，通過Marx scienee網(wǎng)站提供的Mascot wizard軟件查詢與之相匹配的蛋白，搜索結(jié)果見表2(僅列示PX1的指紋圖譜)。

圖2 大鼠股骨組織蛋白2-DE圖譜中蛋白PX1的肽質(zhì)量指紋圖譜

由搜索結(jié)果可看出，Px1為血清轉(zhuǎn)鐵蛋白，Px2為肌酸激酶A，Px3為果糖二磷酸醛縮酶A。

表2 Px1、Px2、Px3在數(shù)據(jù)庫搜索的結(jié)果

3 討論

通過比較不同組間股骨蛋白質(zhì)分子以及圖譜，找到了相對(duì)應(yīng)的差異蛋白質(zhì)，根據(jù)它們質(zhì)和量的不同，分別命名為 Px1、Px2、Px3。

Px1與之相對(duì)的蛋白是Creatine kinase M-type，即肌酸激酶A型。肌酸激酶是一種轉(zhuǎn)移酶類，它廣泛分布于各組織中，分別為 MM(肌肉型)、BB(腦型)、MB(雜化型)，其中M型主要分布在骨骼肌中。研究表明，哺乳動(dòng)物肌細(xì)胞收縮的能量來源于ATP，肌細(xì)胞內(nèi) ATP的數(shù)量足以滿足肌肉收縮30～100次的需要，而肌酸激酶則為快速恢復(fù)ATP含量所必需的高能磷酸化合物，靜息狀態(tài)下肌肉組織中的磷酸肌酸的濃度為ATP的3～8倍。肌細(xì)胞收縮消耗ATP后，磷酸肌酸隨即予以補(bǔ)充，即磷酸肌酸在肌酸激酶的作用下，迅速將高能磷酸鍵轉(zhuǎn)移到ADP上生成ATP，以供肌細(xì)胞的活力;骨質(zhì)疏松時(shí)，骨骼肌收縮力下降，肌肉活力減退，因此肌酸激酶在骨質(zhì)疏松中有很重要的作用，在實(shí)驗(yàn)中，全方組肌酸激酶的活力最強(qiáng)，假手術(shù)組居中，模型組最低，說明壯骨止痛方有可能是通過提高肌酸激酶的活力來達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的。

Px2與之相對(duì)的蛋白是 Serotransferrin，即血清鐵傳遞蛋白，轉(zhuǎn)鐵蛋白是一個(gè)能夠和鐵相結(jié)合的蛋白家族［2］。轉(zhuǎn)鐵蛋白具有多態(tài)性，主要被劃分為血清轉(zhuǎn)鐵蛋白、卵(清)轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳(清)轉(zhuǎn)鐵蛋白3類。血清轉(zhuǎn)鐵蛋白來源于血清，還存在于其他體液如膽汁、羊水、腦脊液、淋巴液和乳汁中，通過這些生物體液結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)鐵離子，其主要作用是在鐵的吸收、貯存、利用中扮演著運(yùn)輸?shù)慕巧?，它調(diào)控著鐵的代謝，阻止游離鐵通過自由基的形成對(duì)細(xì)胞的毒副作用，運(yùn)輸細(xì)胞外的鐵［3］，每分子轉(zhuǎn)鐵蛋白能結(jié)合二元子鐵，因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)的許多酶，例如核糖核苷酸還原酶，需要以鐵作為輔基，因此轉(zhuǎn)鐵蛋白對(duì)細(xì)胞的存活和生長十分重要。另外，轉(zhuǎn)鐵蛋白還能結(jié)合、輸送其他金屬離子、治療性金屬離子、診斷用的放射性金屬離子等。近年來，許多研究結(jié)果認(rèn)為體內(nèi)鐵代謝平衡和紊亂與骨質(zhì)礦化有著密切的聯(lián)系。在研究絕經(jīng)女性骨質(zhì)疏松治療、預(yù)防時(shí)發(fā)現(xiàn)，鐵的攝入與骨的礦化密度呈正相關(guān)［4、5］。在本實(shí)驗(yàn)中，模型組該蛋白相對(duì)表達(dá)，在假手術(shù)組相對(duì)較高，全方組表達(dá)最高，說明切除卵巢也許破壞了轉(zhuǎn)鐵蛋白的運(yùn)輸通道，經(jīng)過壯骨止痛方的治療，在某些方面恢復(fù)了鐵的重新正常轉(zhuǎn)運(yùn)，從而達(dá)到治療骨質(zhì)疏松癥的作用。

Px3與之相對(duì)的蛋白是Fructose-bisphosphate aldolase A，即果糖二磷酸醛縮酶 A，醛縮酶是糖酵解過程中的一個(gè)重要酶類，能催化果糖-1，6-二磷酸(FDP)和果糖-1-磷酸(FIP)為底物的裂解，將其分解為3-磷酸甘油醛和磷酸二羥丙酮。目前研究表明，哺乳動(dòng)物組織中存在3種ALD同工酶，為A型(肌型)、B型(肝型)、C型(腦型)，其中 A型主要存在于肌肉組織中［6］。在臨床中，經(jīng)常以FDP/FIP的比值為單位來測(cè)量人體組織，特別是肌肉組織中的醛縮酶活力［7］。在人體活動(dòng)時(shí)，均需要消耗能量ATP，在ATP的合成過程中，醛縮酶A在糖原或葡萄糖生成ATP，同時(shí)反映生成丙酮酸或乳酸的過程中，并發(fā)揮重要的作用［8］，尤其是 1，6-二磷酸果糖轉(zhuǎn)化為3-磷酸甘油醛中尤顯重要，在整個(gè)反應(yīng)過程里，ATP產(chǎn)生的越多肌肉細(xì)胞則能自由運(yùn)動(dòng)，如果肌酸產(chǎn)生過度，肌肉則活動(dòng)無力甚至易疲勞，故有人把肌酸稱為“疲勞素”。在本實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組醛縮酶A表達(dá)值最高，全方組次之，模型組最低，說明大鼠去卵巢后，醛縮酶A的作用下降，全方組在調(diào)整醛縮酶A的活力方面起到了重要作用，也驗(yàn)證了該方對(duì)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有良好療效。

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R285．5

B

1006-3250(2012)02-0166-03

2009年國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30873291)

楊 軍(1971-)男，甘肅蘭州人，主治醫(yī)師，講師，在讀博士，從事中醫(yī)老年病研究。

2011-07-15