王德山，王 哲，王守巖，馬賢德，高 原，趙金茹，關洪全

(遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847)

腦缺血再灌注損傷后不同時間點施眼針對大鼠海馬組織BDNF表達的影響*

王德山，王 哲，王守巖，馬賢德，高 原，趙金茹，關洪全

(遼寧中醫(yī)藥大學，沈陽 110847)

目的:探討眼針治療CIRI的時間-效果關系以及可能機制。方法:應用線栓法復制CIRI大鼠模型，于再灌注后3h、24h及72h進行眼針刺激，檢測神經(jīng)功能缺損評分，同時檢測大腦海馬組織BDNF蛋白及基因表達。結果:與模型組比較，眼針組神經(jīng)功能缺損評分降低，同時海馬組織BDNF表達呈時間依賴性上調(diào)(P＜0．01)。結論:眼針能夠改善CIRI神經(jīng)功能損傷，并具有時間-效果依賴性，其機制可能與對抗損傷腦組織BDNF表達進行性下調(diào)有關。

眼針;大鼠;腦缺血再灌注損傷;腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子;海馬

眼針療法是我國針灸家彭靜山教授于20世紀70年代始創(chuàng)［1］，依據(jù)中醫(yī)學基本理論以瞳孔為中心放射形地將眼眶周圍劃分為"八區(qū)十三穴"，并將其與五臟六腑以及上、中、下焦相配屬，根據(jù)疾病所屬臟腑選擇不同穴區(qū)針刺達到防治疾病的一種微針療法。30余年逾百萬計病例證明，眼針對多種疾病均有療效［2、3］，特別是對腦缺血致殘性疾病效果突出［4、5］。本研究通過建立大鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)模型，觀察在CIRI后不同時間點進行眼針刺激對大鼠神經(jīng)功能缺損評分和海馬組織腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neuro-trophic factor，BDNF)表達的影響，旨在探討眼針治療 CIRI的時間-效果關系，為臨床建立眼針治療CIRI方案提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動物與分組

健康SPF級SD大鼠120只，雌雄不拘，體質(zhì)量280g±20g，由北京維通利華實驗動物中心提供(許可證編號SCXK(京)2007-0001)。適應性喂養(yǎng)1周后分為10組，即正常組、假手術組、模型組、眼針組分3h、24h、72h各3組，每組12只。模型組和眼針組動物在模型復制成功后再次進行隨機分組。

1．2 動物模型復制與評價標準

參照文獻［6］，模型組及眼針組采用改良的線栓法復制大鼠大腦中動脈缺血(CIRI)模型，再灌注時間為缺血 2h后進行。CIRI模型成功標準:參照Longa評分標準［7］對再灌注后動物進行神經(jīng)功能缺損評分。0分為無癥狀;1分為不能完全伸展對側前爪;2分為向?qū)绒D(zhuǎn)圈;3分為向?qū)葍A倒;4分為不能自發(fā)行走，意識喪失。評分為1～3分者納入實驗組，未達標準者排除。假手術組術式同模型組和眼針組，但是栓塞線插入深度為0．5cm，不進行栓塞處理。正常組未做任何處理。

1．3 眼針取穴及刺法眼針取穴參照文獻［8］選取雙側肝區(qū)、上焦區(qū)、下焦區(qū)、腎區(qū)穴。刺法:用31號13mm毫針，采用橫刺法。于大鼠眼眶外緣處，按照穴區(qū)1→8區(qū)的順序，由穴區(qū)定位線起點進針，刺入皮下橫刺到另一穴區(qū)起點線，保持針體在所選穴區(qū)內(nèi)。刺入后不提插捻轉(zhuǎn)，留針20min，留針期間在10min時刮針柄5次，以加強刺激。治療時間:3h眼針組于腦缺血再灌注后即刻和取材前30min分別進行眼針刺激，計2次;24h、72h組每間隔12h眼針1次，最終24h組眼針計4次，72h組眼針計8次。刺法同3h組。

1．4 試劑

實時熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa大連寶生物。BDNF引物由北京華大基因公司合成。親和純化兔抗鼠BDNF多克隆抗體、DAB染色試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司。

1．5 檢測指標測定

1．5．1 海馬組織BDNF蛋白表達(Western blot法) 于缺血再灌注損傷3h、24h、72 h給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉后斷頭取出腦組織，去掉小腦，沿兩側大腦半球連接處將大腦半球切開，剝離出病變側海馬，按海馬組織凈重∶裂解液 =1∶10的比例，加入相應體積的裂解液，pH值為7．5，將樣品剪碎后勻漿、離心、上清即為總蛋白。兔抗鼠BDNF一抗(1∶500);O-dianidine，β-naphthyl acid phosphate 顯色;掃描儀掃描NC膜，分析結果。

1．5．2 海馬組織 BDNF mRNA的表達 采用RQ-PCR方法:BDNF上游引物:5'ATGGGTTA CACG AAGGA 3';AQP4下游引物:5'GCCCGAA CATACGATT3'。β-actin為內(nèi)參，其上下游引物分別為:5'CGT GCGTGACATTAAAGAG 3'，5'TTGCCG ATAGTGA TGACCT 3'。所有產(chǎn)物，在 ABI Prism 7500 HT序列檢測系統(tǒng)中運行。讀取CT值，以管家基因β-actin為內(nèi)參，以擴增倍數(shù)作為比較的依據(jù)，△CT=CT目的基因-CTβ-actin，△△CT=△CT實驗－△CT對照，擴增倍數(shù)=2－△△CT。將所擴增的PCR產(chǎn)物同時進行溶解曲線分析。

1．6 統(tǒng)計學處理

2 結果

2．1 不同時間點施眼針對模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分影響

本實驗過程中大鼠死亡32只，因此最終各實驗組動物樣本數(shù)出現(xiàn)差異。模型復制成功后動物均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能障礙，如提尾時左側前肢不能伸直，行走向?qū)刃D(zhuǎn)或傾倒等。假手術組與正常組大鼠無神經(jīng)功能障礙表現(xiàn)。神經(jīng)功能缺損評分結果如表1所示，與正常組和假手術組比較，模型組評分值明顯增高(P＜0．01)。眼針刺激后3h、24h、72h組與模型組比較，神經(jīng)功能缺損評分均較模型組有顯著降低(P＜0．01);其中 3h、24h組評分較72h組更低，但是3個不同時間點之間沒有顯著性差異(P ＞0．01)。

表1 不同時間點施眼針對模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分影響

2．2 不同時間點施眼針對模型大鼠海馬組織BDNF蛋白表達的影響

圖1、表2為采用 Western blot方法檢測結果:取大鼠右側海馬組織檢測BDNF蛋白，以β-actin為內(nèi)參，模型組海馬組織不同時間點BDNF蛋白表達均明顯低于其他各組，并且BDNF蛋白表達呈現(xiàn)時間依賴性下調(diào);模型組組內(nèi)3個時間點比較，72h組BDNF蛋白表達最低(P＜0．01)。眼針組 BDNF蛋白表達明顯高于模型組(P＜0．01)，其中眼針3h和24h組與72h組比較，72h組明顯低于前2組(P＜0．01)。這可能與腦缺血再灌注損傷72h時 BDNF蛋白表達下調(diào)更明顯有關。

表2 不同時間點施眼針對模型大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(灰度值)影響

圖1 眼針對腦缺血再灌注損傷模型大鼠海馬組織BDNF蛋白表達影響

2．3 CIRI后不同時間點施眼針對大鼠海馬組織BDNFmRNA表達的影響

采用實時定量PCR方法檢測海馬組織BDNFmRNA表達，本實驗選用 β-actin作為內(nèi)參，BDNF基因擴增產(chǎn)物大小為86bp，β-actin基因擴增產(chǎn)物為132 bp。其檢測結果如表3所示，與正常組和假手術組比較，模型組海馬組織BDNF mRNA表達明顯減少，并且也呈現(xiàn)出時間依賴性下調(diào)，特別是72h組與3h組比較差異顯著(P＜0．01)。與模型組比較，眼針組的3個時間點 BDNF mRNA均呈現(xiàn)高表達(P＜0．01)，但3個時間點間沒有顯著性差異(P ＞0．01)。

表3 不同時間點施眼針對模型大鼠海馬組織BDNFmRNA表達影響(倍數(shù))

3 討論

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族重要成員之一，是由Barde等在1982年從豬腦中首先分離和純化出的神經(jīng)生長因子。BDNF廣泛分布在腦中樞各個部位，包括大腦皮層、海馬、基底前腦、紋狀體、下丘腦和小腦等。BDNF不僅分布于神經(jīng)細胞體內(nèi)，而且延伸到突起纖維中，是腦組織中含量最多的神經(jīng)營養(yǎng)因子之一，具有調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、促進成熟、維持神經(jīng)元生長等功能。體外及體內(nèi)實驗研究均證實，BDNF在神經(jīng)元存活、神經(jīng)發(fā)生分化和增殖以及學習、記憶等方面扮演著重要的角色［9］。近來研究已表明，BDNF在腦缺血再灌注損傷缺血周邊區(qū)域神經(jīng)元的損傷修復中發(fā)揮了重要作用［10］。當機體發(fā)生腦缺血再灌注損傷后，其腦神經(jīng)細胞的損傷程度與BDNF的表達水平密切相關，BDNF mRNA表達水平增強能夠提高神經(jīng)元抗缺血再灌注損傷的能力［11］。從而證明了 BDNF在維持神經(jīng)元功能及其損傷后再生修復方面發(fā)揮著重要作用。

本實驗結果顯示，與正常組和假手術組比較，模型組中不論是3h、24h還是72h組的神經(jīng)功能缺損評分均明顯呈現(xiàn)出高值，表明本實驗中的CIRI模型復制是成功的。與模型組比較，眼針組中3個時間點的神經(jīng)功能缺損評分出現(xiàn)明顯下降，證明眼針治療能夠改善CIRI模型大鼠的神經(jīng)功能以及整體狀態(tài)。

BDNF的檢測結果表明，模型組3h、24h和72h組海馬組織BDNF不論是蛋白還是基因表達均呈現(xiàn)時間依賴遞減性下調(diào)，以缺血再灌注72h時BDNF表達下調(diào)最為明顯，提示在腦缺血再灌注損傷后的72h期間，其腦組織損傷程度具有進行性加劇的趨勢，即腦缺血再灌注后經(jīng)歷時間越長腦損傷越加重。經(jīng)過眼針刺激后，伴隨著CIRI模型大鼠整體狀態(tài)的好轉(zhuǎn)其神經(jīng)功能缺損評分也呈現(xiàn)明顯下降，同時眼針組大鼠海馬組織的BDNF表達在3個不同時間點上也呈現(xiàn)出同步上調(diào)，說明CIRI模型大鼠神經(jīng)功能損傷與腦組織中BDNF表達下調(diào)具有密切的關系。比較本實驗中眼針組與模型組相對應的3個時間點的BDNF表達結果發(fā)現(xiàn)，盡管模型組BDNF表達呈時間依賴性下調(diào)，以 72h達到最低，但是眼針組BDNF表達卻沒有出現(xiàn)呈時間依賴性下調(diào)，即使在72h組其表達與其他2個時間點也并無顯著性差異。此結果不但表明眼針可能通過增強腦組織BDNF表達以提高腦組織的抗損傷能力，同時也提示，眼針治療的次數(shù)增加能夠明顯提高腦組織BDNF表達以加強眼針的治療效果，即眼針治療存在著“時間-效果”依賴性關系。

根據(jù)本實驗結果初步認為，由于缺血性腦組織的BDNF表達在腦缺血再灌注后，具有時間依賴性下調(diào)的現(xiàn)象，這種表達下調(diào)有加劇神經(jīng)功能缺損的作用。因此，臨床上應用眼針治療腦缺血性疾病應盡早施行。鑒于眼針對腦缺血再灌注損傷治療存在著“時-效”性關系，所以對于腦缺血再灌注性疾病在進行早期治療同時，還應該在可能的情況下盡量增加眼針刺激的次數(shù)，以增強眼針的治療效果。

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Effect of Eye acupuncture therapy on BDNF expression in rats with hippocampus ischemia-reperfusion injury at different time periods

WANG De-shan，WANG Zhe，WANG Shou-yan，MA Xian-de，GAO Yuan，ZHAO Jin-ru，GUAN Hong-quan(Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Shenyang110847，China)

Objective:To investigate time-effect relationship between eye acupuncture and curative effect of CIRI and the possible mechanisms．Methods:Establishing the rat model of CIRI with suture method．3h，24h and 72h after reperfusion，the neurophysical behaviours were accessed by ZeaLonga neurophysical impairment marks．The methods of Western-blotting and RQ-PCR were taken to detect the alteration of the BDNF protein and BDNF mRNA in rat hippocampus after the eye acupuncture therapy．Results:The expression of the BDNF protein and BDNF mRNA in rat hippocampus after the eye acupuncture therapy was strongly increased at 3h，24h and 72h．The expression of the BDNF at 24h were higher than those at other periods(P ＜ 0．01)．Conclusion:The eye acupuncture therapy can improve the CIRI evidently，the curative effect at 24h is superior to that at 3h and at 72h．It is related to increasing the expression of hippocampus BDNF．．

Eye acupuncture;cerebralischemia-reperfusion injury;brain-deprived neurotrophic factor;hippocampus;real-time fluorescence quantitative polyme rase chain reaction

R245．32+9

B

1006-3250(2012)02-0200-03

國家重點基礎研究發(fā)展計劃項目(2007CB512702)

王德山(1951-)，男，遼寧大連人，教授，醫(yī)學碩士，從事中醫(yī)藥對消化道神經(jīng)內(nèi)分泌功能影響機制研究。

2011-07-27