閆學(xué)文，單士軍

（1.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津300120；2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津 300154）

中波紫外線（ultraviolet B,UVB）照射后，角質(zhì)形成細(xì)胞（keratinocyte cell,KC）產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，其中白細(xì)胞介素 1α（interleukin-1α,IL-1α）與皮膚光老化的作用極為密切。作為一種前炎癥介質(zhì)，IL-1α在UVB急性損傷后直接或間接影響皮膚中的免疫細(xì)胞及周圍細(xì)胞，在免疫調(diào)節(jié)、炎癥發(fā)生以及促進(jìn)組織增生方面起了重要作用[1]。研究表明，水通道蛋白3（aquaporin 3，AQP3）表達(dá)于正常皮膚的基底細(xì)胞細(xì)胞膜，是水和甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)通道。在皮膚炎癥、應(yīng)激或某些慢性疾病以及腫瘤等情況下，AQP3表達(dá)發(fā)生變化[2]。但I(xiàn)L-1α和AQP3之間的關(guān)系尚未見報(bào)道。本研究以體外培養(yǎng)的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT）為靶細(xì)胞，觀察IL-1α處理后HaCaT細(xì)胞AQP3 mRNA和蛋白表達(dá)的變化。初步探討其作用機(jī)理和臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 HaCaT由德國(guó)柏林自由大學(xué)本杰明·富蘭克林醫(yī)學(xué)中心惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司?？谷薃QP3多克隆抗體由萬寅生教授惠贈(zèng)。Trizol RNA提取試劑為Invitrogen公司產(chǎn)品?？俁NA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、RealMasterMix新型熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。引物由北京賽百盛公司合成。重組人IL-1α購(gòu)自美國(guó)CaliforniaBioscience公司。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)自行設(shè)計(jì)引物。內(nèi)參GAPDH，上游引物:5′-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3′；下游引物，5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物313 bp。AQP3，上游引物：5′-GCT GTC ACT CTG GGC ATC CTC-3′；下游引物：5′-GCG TCT GTG CCA GGG TGT AG-3′；擴(kuò)增產(chǎn)物 133bp。

1.2 主要儀器設(shè)備 細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(tái)（蚌埠凈化設(shè)備廠）、CO2培養(yǎng)箱（Queue SystemsTM2711美國(guó)）、倒置相差顯微鏡（OLYMPUS，I×70日本）、全能型高性能臺(tái)式冷凍離心機(jī)（Heaeus,Biofuge Stratos德國(guó)）、深低溫冰箱（SANYO，Altra Low日本）、蒸汽高壓消毒箱（Tuttnauer,2540 MK美國(guó)）、550型酶標(biāo)儀（Bio-Rad Laboratories Inc,Hercules加拿大）、實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）儀（Rotor-gene 3000,澳大利亞）、Waldmann窄波UVB治療儀（Waldmann，UV801KL德國(guó)）。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于5%CO2、37℃孵箱中傳代培養(yǎng)。

2.2 L-1α處理 待HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)至約80%融合，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基，加IL-1α繼續(xù)培養(yǎng)。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 1)陰性對(duì)照組:培養(yǎng)液對(duì)照；2）加入 IL-1α 1、10、100 μg/L，培養(yǎng) 24 h 后檢測(cè)信使核糖核酸（massenger ribose nucleic acid,mRNA）及蛋白的變化；加入 IL-1α 10 μg/L，分別培養(yǎng) 6、12、24 h后檢測(cè)mRNA及蛋白的變化。收集的培養(yǎng)上清或細(xì)胞保存于-80℃深低溫冰箱或直接實(shí)驗(yàn)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶全連鎖反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR）檢測(cè)AQP3 mRNA表達(dá)

2.4.1 總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA （1）收集HaCaT細(xì)胞，向每管約5×106個(gè)細(xì)胞中加入0.5 mL Trizol總RNA提取試劑，輕輕吹打，將均漿樣本放于室溫5 min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分解。（2）加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置10min。（3）4℃，12000轉(zhuǎn)/min離心15 min。（4）小心將上層無色水相移至新的Eppendorf管中。（5）緩慢加入1倍體積70%乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入試劑盒提供的吸附柱中。（6）4℃下以12 000×g的速度離心10 min，離心后在管的底部及管壁可以看到凝膠狀RNA小滴。棄去收集管中的廢液，加入1 mL 75%乙醇洗RNA小滴1次，渦旋混合樣本。（7）4℃下以7 500×g的速度離心5 min，室溫下空氣干燥5～10 min。（8） 用 0.1 mL焦碳酸二乙酯（diethypyrocarbonate,DEPC）水溶解RNA，55～60℃孵育10min。（9）取10μLRNA溶液，加990μLDEPC水稀釋，在紫外分光光度計(jì)內(nèi)測(cè)定RNA溶液在260nm及280nm處的光密度（A）值。A 260/A 280>1.7時(shí)標(biāo)本可用，否則重新提取。根據(jù)A 260值計(jì)算RNA濃度。

2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄 （1）在冰浴的無核酸酶的離心管中加入 2 μg總 RNA，2 μL Random，2 μL dNTP，補(bǔ)RNase-free水定容至 13.5 μL。（2）70℃加熱 5 min后迅速在冰上冷卻2 min，瞬時(shí)離心收集反應(yīng)液后加入 4 μL 5 × first-strand buffer,1 μL 0.1MDTT，0.5 μL RNasin。（3） 加 1 μL TIANScript M-MLV 混勻。25℃溫浴10 min，42℃溫浴50 min，95℃加熱5 min終止反應(yīng)，RNase-free ddH2O將體系稀釋至30 μL，-20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.4.3 PCR 反應(yīng) （1）20×SYBR solution室溫平衡并徹底混勻。（2）將 125 μL 20×SYBR solution 加入至1 mL 2.5×RealMasterMix中。（3）在平頭PCR管中分別加入 2.5×RealMasterMix/20×SYRB solution 9 μL，正向引物及負(fù)向引物各2 μL，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 2 μL，超純水 5 μL。反應(yīng)體系為 20 μL。（4）在 RG3000 定量PCR儀上按照RealMasterMix新型熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)：95℃起始變性2 min，94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸30 s。用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)AQP3基因進(jìn)行相對(duì)定量測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

2.5 western blot分析

2.5.1 收集細(xì)胞 胰蛋白酶消化各組培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，離心后收集。

2.5.2 總蛋白的提取 在盛有收集好細(xì)胞的Eppendorf管中加入500 μL蛋白裂解液（50 mm Tris-HclpH7.4，150mmNacl，0.l%SDS,1%Triton-100；1mmEDTA pH8.0），冰浴下超聲粉碎。4℃12000轉(zhuǎn)/m，離心30 min。

2.5.3 樣品蛋白濃度的定量樣本取25 μL+2.5 mL堿性銅液室溫靜置20 min，加入0.25 mL酚試劑室溫靜置30 min?？瞻坠軜悠芬?5 μL BD H2O代替。722s分光光度計(jì)測(cè)光密度值，計(jì)算蛋白濃度。

2.5.4 濃度的調(diào)整與樣品的處理把樣品調(diào)成相同濃度，濃度高的用蒸餾水補(bǔ)充，然后加入buffer，Eppendorf管用沸水煮5 min（使蛋白變性）。

2.5.5 電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、染色:取20 μL細(xì)胞裂解液進(jìn)行不連續(xù)10%十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳，90V恒定電壓使溴酚藍(lán)染料從4%濃縮膠進(jìn)入8%分離膠后，以120 V恒定電壓電泳至適當(dāng)位置，4℃條件下用半干式電轉(zhuǎn)儀將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上。5%脫脂奶粉封閉非特異性蛋白，室溫，過夜。封閉好的膜用緩沖液TTBS（0.5 mL Tween-20加到1 000 mL TBS中。TBS組成：4.84 Tris，58.48 Nacl，溶于去離子水中，用 Hcl調(diào)PH至7.5）沖洗2次，每次5 min，按說明書要求的濃度加入待檢測(cè)的一抗，室溫2 h。TTBS沖洗2次，每次5 min。加堿性磷酸酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，室溫孵育2 h。TTBS沖洗2次，每次5 min，TBS沖洗1次，5 min，加入堿性磷酶顯色液顯色，10～30 min后看結(jié)果。結(jié)果采用FluorChem 2.0分析軟件掃描定量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

相應(yīng)數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較用方差分析，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.1 IL-1α 1、10、100 μg/L 處理后 HaCaT 細(xì)胞AQP3 mRNA表達(dá)的變化分析實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果，以陰性組為基準(zhǔn)，預(yù)設(shè)其AQP3 mRNA表達(dá)水平為1.0，采用單因素4水平設(shè)計(jì)定量資料的方差分析，顯示四組之間總體來說差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001）。組間比較采用snk檢驗(yàn)，各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1。

3.2 western blot分析結(jié)果 western blot結(jié)果顯示，IL-1α 1、10、100 μg/L 處理后，HaCaT 細(xì)胞 AQP3 蛋白表達(dá)下降，以100 μg/L組下降最為明顯。10 μg/L處理6 h下降最為明顯，至12 h表達(dá)逐漸回復(fù)，見圖 1，2。

表 1 IL-1α 1、10、100 μg/L 對(duì) HaCaT 細(xì)胞AQP3 mRNA表達(dá)的影響

4 討論

AQP3是的水和甘油透膜轉(zhuǎn)運(yùn)的通道蛋白，僅表達(dá)于正常皮膚基底細(xì)胞細(xì)胞膜上[3]。在某些生理或病理情況下，AQP3表達(dá)發(fā)生變化。有研究表明，當(dāng)體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞處于高滲狀態(tài)時(shí)，AQP3 mRNA表達(dá)上調(diào)，尤其是當(dāng)處于山梨醇的高滲環(huán)境中[4]，但其機(jī)制未明。在特應(yīng)性皮炎急性期或慢性期，AQP3 mRNA表達(dá)上調(diào)，并且表達(dá)位置亦較正常的基底細(xì)胞層上升，棘細(xì)胞層也表達(dá)AQP3。這和特應(yīng)性皮炎患者透皮失水，皮膚干燥有密切的聯(lián)系[3]。但AQP3在特應(yīng)性皮炎過表達(dá)的機(jī)制尚不明確。另有研究報(bào)道，當(dāng)機(jī)體處于炎癥狀態(tài)下，前炎癥介質(zhì)TNF-α也可以促進(jìn)AQP3過表達(dá)，同時(shí)表達(dá)部位發(fā)生變化[2]。由此可見，目前對(duì)AQP3在體內(nèi)體外各種生理、病理情況下發(fā)生的表達(dá)變化機(jī)制并不明確。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IL-1α作用于體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞，在mRNA和蛋白水平均有明顯的抑制作用，并具有劑量/時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系，這一變化發(fā)生的機(jī)制尚需要進(jìn)一步的探討。

UVB照射后可以增加HaCaT細(xì)胞IL-1α的分泌，而IL-1α又可以抑制HaCaT細(xì)胞AQP3的表達(dá)[5]。同時(shí)我們也觀測(cè)到UVB照射后HaCaT細(xì)胞AQP3表達(dá)的抑制。因此我們不能確定是UVB照射后直接通過信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制誘導(dǎo)了AQP3表達(dá)的抑制，還是通過IL-1α間接抑制了AQP3表達(dá)的表達(dá)，值得我們進(jìn)一步研究。

［1］Hara-Chikuma M,Verkman AS.Aquaporin-3 facilitates epidermal cell migration and proliferation during wound healing[J].J Mol Med(Berl),2008,86:221-231.

［2］Tancharoen S,Matsuyama T,Abeyama K,et al.The role of water channel aquaporin 3 in the mechanism of TNF-alpha-mediated proinflammatory events:Implication in periodontal inflammation[J].J Cell Physiol,2008,217:338-349.

［3］Sugiyama Y,Ota Y,Hara M,et al.Osmotic stress up-regulates aquaporin-3 gene expression in cultured human keratinocytes[J].Biochim Biophys Acta,2001,1 522:82-88.

［4］Olsson M,Broberg A,Jernas M,et al.Increased expression of aquaporin 3 in atopic eczema[J].Allergy,2006,61:1 132-1 137.

［5］Ho JN,Lee YH,Lee YD,et al.Inhibitory effect of Aucubin isolated from Eucommia ulmoides against UVB-induced matrix metallopro teinase-1 production in human skin fibroblasts[J].Biosci Biotechnol Biochem,2005,69:2 227-2 231.