陳靜宇 ，林新瑜 ，王芳 ，林鴻剛

（1.成都市第六人民醫(yī)院，成都610051；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院，成都610072；3.四川大學(xué)國家生物治療重點實驗室，成都 610041）

黃褐斑、白癜風(fēng)等是臨床上常見的色素障礙性疾病，目前其發(fā)病機制還不十分清楚,治療難度也較大。皮膚顏色的深淺主要取決于黑素細胞產(chǎn)生黑素的量和分布。通過黑素細胞的體外純培養(yǎng)可以研究色素障礙性疾病的發(fā)病機制，篩選治療這些疾病的藥物和方法。本研究建立正常人表皮黑素細胞體外培養(yǎng)體系，采用不同濃度的白細胞介素 4（interleukin-4，IL-4）作用于體外培養(yǎng)的黑素細胞，觀察其對黑素細胞增殖及黑素合成的影響，為臨床應(yīng)用IL-4治療色素性疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器 MCDB-153培養(yǎng)基，牛胰島素，人轉(zhuǎn)鐵蛋白，左旋多巴（levodopa,L-Dopa），IL-4，二甲基亞砜（DimethylSulphoxide），MTT均購自美國Sigma公司。重組人表皮生長因子（recombinant human epidermal growth factor,rhEGF）購于美國Peprotech公司。牛垂體提取物（bovine pituitary extract,BPE）購于美國Invitrogen公司。10%新生小牛血清購自Hyclone公司。乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-Na2）購自美國Gibco公司。氫化可的松0.5 μg/mL，青霉素100 IU/mL，鏈霉素100 IU/mL，胰蛋白酶，臺盼蘭均系國產(chǎn)。培養(yǎng)瓶、96孔板和6孔板均購于美國Corning公司。顯微鏡：觀察細胞用的是OLYMPUS CK2型號；細胞計數(shù)用的是OLYMPUS CKX41型號，照相用的OLYMPUSCH2型號；酶聯(lián)免疫檢測儀；流式細胞儀。標(biāo)本經(jīng)患者知情同意后取自18～35歲行包皮環(huán)切術(shù)的正常人包皮。

1.2 方法

1.2.1 正常人黑素細胞的培養(yǎng)[1-4]將上述包皮放入含青霉素、鏈霉素濃度為100 IU/mL的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）中，取出后在超凈臺上用組織剪剪去皮下組織，再用PBS液反復(fù)徹底沖洗。移入含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶約20 mL的無菌瓶中，蓋緊，于4℃冰箱中消化18～24 h。棄去胰蛋白酶，加入PBS液洗滌組織塊數(shù)次。用眼科鑷剝離角質(zhì)層，可見角質(zhì)層下面附著一層呈黑色的細胞，去除角質(zhì)層后將組織塊移入新的PBS液中振蕩輕刮將黑素細胞層懸浮，再將含有黑素細胞的液體收集至離心管中。用PBS液反復(fù)離心洗滌細胞懸液3次，每次1 500轉(zhuǎn)/min離心3 min。棄上清，將細胞沉淀物用黑素細胞生長培養(yǎng)基重新懸浮，并用臺盼蘭染色計數(shù)（細胞活力≥95%），按2×105個/cm2的細胞密度接種于6孔板中，于37℃、5%CO2條件培養(yǎng)48 h后換液去除未貼壁細胞，以后適時更新培養(yǎng)液。

1.2.2 黑素細胞鑒定[5]

1.2.2.1 左旋多巴（L-Dopa）染色 將傳代純化后的黑素細胞，經(jīng)含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化后接種于已預(yù)先放置蓋玻片的6孔板內(nèi)，待細胞貼壁并穩(wěn)定生長后棄去培養(yǎng)液，并用預(yù)熱的PBS液洗滌數(shù)次。用2.5 g/L戊二醛固定后，加入用黑素細胞培養(yǎng)液配制的1 g/L L-Dopa，37℃孵育4 h，其間換液1次，風(fēng)干后甘油封片，照相。

1.2.2.2 Fontana銀染 在0.15%硝酸銀溶液中加入適量氨水配制成氨銀液，將傳代純化的黑素細胞用戊二醛固定后加入氨銀液，避光浸染約30 min，PBS液漂洗3次后置倒置顯微鏡下觀察，照相。

1.2.2.3 S-100蛋白免疫組化染色 將傳代純化后的黑素細胞，經(jīng)消化后接種于已預(yù)先放置蓋玻片的6孔培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞貼壁后去掉培養(yǎng)液。用2.5 g/L戊二醛固定后，PBS液洗滌數(shù)次，加入3%的H2O2，室溫30 min，以去除內(nèi)源性過氧化物酶；再次用PBS液洗滌數(shù)次，滴加1∶20稀釋的羊血清，室溫下處理15 min；加入1∶200兔抗S-100蛋白的多克隆抗體，4℃過夜；洗滌后加入生物素標(biāo)記的羊抗兔抗體，37℃、濕盒孵育1 h，再次洗滌后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，37℃、濕盒孵育1 h。洗滌后二氨基聯(lián)苯胺（DAB）染色，蒸餾水適時終止，蘇木素復(fù)染后用加拿大膠封片，照相。

1.2.3 黑素細胞增殖的測定 采用四甲基偶氮唑藍比色法（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）。倒置顯微鏡下觀察，細胞培養(yǎng)至80%匯合時，棄培養(yǎng)液上清，加入含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶共1～1.5 mL，在75 cm2的細胞培養(yǎng)瓶內(nèi)37℃孵育3～5 min，鏡下觀察約80%脫落，加入5 mL左右的含有10%新生小牛血清的MDCB-153培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移細胞懸液到15 mL離心管，1 500轉(zhuǎn)/min離心3 min，棄去上清，加入適量含有10%血清的MDCB-153培養(yǎng)基重懸細胞團塊，吸取100 μL到一個無菌的500 μL的EP管中，加入等量的0.8%的苔盼蘭溶液，室溫下混勻5 min，吸取100μL混合液于血細胞計數(shù)板計數(shù)。按20000個/mL接種到96孔板中，每孔 150 μL，37 ℃，5%CO2孵箱過夜培養(yǎng)。

第2天，棄去培養(yǎng)基上清，加入新鮮的MDCB-153培養(yǎng)基100 μL/孔，備用。以無菌PBS配置的IL-4 溶液，其終濃度分別為 50，100，200 μg/L，備用。無菌加入100 μL相應(yīng)濃度的IL-4溶液，同時設(shè)立PBS和空白對照組，各個濃度各設(shè)5個復(fù)孔。處理后分別培養(yǎng)24，48，72 h。相應(yīng)處理時間后，分別棄去培養(yǎng)基上清，加入含MTT終濃度為0.5 g/L的新鮮MDCB-153培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4 h，800轉(zhuǎn)/min離心3 min，棄去培養(yǎng)基上清，加入150 μL的DMSO溶解甲瓚，37℃孵育15 min，于波長為495 nm處測吸光度值，記錄數(shù)據(jù)，按公式計算其凈抑制率。抑制率=（對照組-實驗組）/對照組×100%，凈抑制率=各組的抑制率-溶劑對照組（PBS）的抑制率。

1.2.4 黑素合成的測定 采用氫氧化鈉（NaOH）法。將處理后的黑素細胞棄去上清液。PBS洗3次，用含0.2 g/L EDTA-Na2的0.25%胰蛋白酶消化3 min后，分別計數(shù)后調(diào)整細胞數(shù)目，取等數(shù)量的細胞離心后重懸于100 μL的0.5 mmol/L的NaOH溶液中，37℃孵育1 h后，各管加入400 μL的蒸餾水稀釋后，分別于405 nm處和450 nm測量吸光度值，按公式計算其抑制率。黑素合成抑制率=[1-（藥物孔吸光度值÷藥物孔細胞密度）÷（對照孔吸光度值÷對照孔細胞密度）]×100%。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測 細胞培養(yǎng)，計數(shù)等如前，按2×105/孔接種到6孔板，濃度100 μg/L的IL-4處理組和PBS對照組，空白對照組設(shè)置如前，細胞處理72 h后，分別收集培養(yǎng)基上清到離心管中，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，消化終止如前。分別收集細胞懸液轉(zhuǎn)到相應(yīng)的已經(jīng)收集有各自上清的離心管里，1 500轉(zhuǎn)/min離心3 min，棄去上清，加入無菌的PBS重懸細胞團塊，1500轉(zhuǎn)/min離心3min，重復(fù)3次PBS清洗過程后，棄去上清，加入PI溶液，室溫避光孵育30 min，上機檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 全部數(shù)據(jù)采用SPSS10.0版統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)結(jié)果 體外培養(yǎng)的正常人黑素細胞為雙極、三極和多極的樹突狀細胞，細胞增殖良好,細胞樹突之間交織成網(wǎng)，見圖1。

2.2 黑素細胞鑒定

2.2.1 L-Dopa染色 第3代黑素細胞經(jīng)0.1%LDopa染色后鏡下見黑素細胞胞質(zhì)及樹突均被染成灰黑色，見圖2。

2.2.2 Fontana銀染 第3代黑素細胞經(jīng)氨銀液避光浸染30 min，細胞被染成黑色，見圖3。

2.2.3 S-100蛋白染色 黑素細胞胞質(zhì)及樹突呈棕黃色陽性著色從而可以鑒定為黑素細胞，見圖4。

2.3 不同濃度IL-4對人正常皮膚黑素細胞增殖率（%）的影響 黑素細胞增殖的測定結(jié)果見表1，2。

表1 不同濃度IL-4與PBS作用于黑素細胞后的抑制率的比較

表2 不同濃度IL-4作用于黑素細胞后的凈抑制率比較

抑制率=（對照組-實驗組）/對照組×100%。凈抑制率=各組的抑制率-溶劑對照組（PBS）的抑制率。隨作用時間增加，黑素細胞凈抑制率逐漸增加，而且隨IL-4的濃度增加，黑素細胞的凈抑制率也逐漸增加，說明其對黑素細胞的作用呈現(xiàn)出時間和劑量的相關(guān)性。

2.4 黑素合成的測定結(jié)果 405 nm處和450 nm處分別測量吸光度值，按公式計算其黑素合成抑制率，均可見IL-4作用后黑素合成抑制率增加，而且IL-4組與PBS組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05#），見表3。

表3 IL-4作用于黑素細胞后的黑素合成抑制率的比較

2.5 流式細胞術(shù)檢測 濃度為100 μg/L的IL-4作用于黑素細胞72 h后用流式細胞術(shù)檢測的結(jié)果：空白對照組黑素細胞凋亡率為4.0%，溶劑PBS組黑素細胞凋亡率為 6.7%，IL-4（100 μg/L）組黑素細胞凋亡率為59.2%。IL-4（100 μg/L）組黑素細胞凋亡率與空白對照組及溶劑PBS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

黑素的合成是個極其復(fù)雜的過程，在體內(nèi)受細胞因子、金屬離子、激素水平等各種因素的調(diào)節(jié)。黑素合成與機體免疫應(yīng)答及細胞因子間相互作用已引起學(xué)者們的關(guān)注。Th細胞按其分泌細胞因子不同而分為Th1和Th2亞群，前者分泌IL-2，γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）；后者分泌 IL-4、IL-5、IL-10等[6]。Th1和Th2之間相互調(diào)節(jié)、相互制約，處于動態(tài)平衡，維持機體正常的細胞免疫和體液免疫。Th1細胞分泌的細胞因子參與T細胞介導(dǎo)的細胞免疫，而Th2細胞分泌的細胞因子參與體液免疫。IL-4是一種Th2型細胞因子，具有調(diào)節(jié)Th1/Th2型細胞因子平衡作用[7]。隋連金等[8]采用酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immuno sorbent assay,ELISA）法測定白癜風(fēng)患者血清IL-4水平，并與正常對照組相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者血清IL-4水平增高,且進展期高于穩(wěn)定期，提示此種細胞因子可能參與白癜風(fēng)發(fā)病，并與白癜風(fēng)的活動有關(guān)。其作用可能與細胞因子及一些化學(xué)介質(zhì)如：一氧化氮（NO）、神經(jīng)肽（NPY）等的相互作用有關(guān)[9]。鐘文俊等[10]發(fā)現(xiàn)白癜風(fēng)患者在進行戶外紫外線（ultraviolet radiation B，UVB）照射前局部組織液的IL-4、IFN-γ水平均較高，表明在白癜風(fēng)的皮損處，Th細胞有較高的表達，而在治療后IL-4、IFN-γ水平均下降，提示可能在UVB照射下Th細胞活性受抑制。黑素細胞的培養(yǎng)在皮膚色素性疾病、惡性黑色素瘤等的研究和治療中具有重要意義。IL-4對體外培養(yǎng)的黑素細胞的作用國內(nèi)尚無相關(guān)報道。本研究建立正常人表皮黑素細胞體外培養(yǎng)體系后，用不同濃度的IL-4作用于黑素細胞后也發(fā)現(xiàn)IL-4對黑素細胞活力有抑制作用，能使細胞增殖力降低，黑素合成減少，增加黑素細胞的凋亡率。這為臨床應(yīng)用IL-4治療色素性疾病提供了實驗依據(jù)，但是IL-4是通過什么機制達到這些作用還有待進一步的研究。

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