盧松茂， 羅金水， 張漢榮， 余智城， 林智明， 林秀香

（福建省熱帶作物科學(xué)研究所，漳州 363001）

柑橘黑斑病菌生物學(xué)特性研究

盧松茂， 羅金水， 張漢榮， 余智城， 林智明， 林秀香

（福建省熱帶作物科學(xué)研究所，漳州 363001）

本文測定了不同培養(yǎng)基、溫度、pH、光照條件對柑橘黑斑病菌柑橘葉點霉（Phyllostictacitricarpa）菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響，以明確其生物學(xué)特性。結(jié)果表明，該菌最適生長的培養(yǎng)基為燕麥片瓊脂培養(yǎng)基（OA）；菌絲最適生長溫度為25～30℃，最適pH為5～7；在12h光暗交替條件下生長最好，全黑暗條件下生長最慢。分生孢子萌發(fā)最適溫度為25℃，最適pH為6，以在0.2%葡萄糖溶液中的萌發(fā)率最高。菌絲和分生孢子在55℃水浴處理10min均失活。

柑橘黑斑?。?柑橘葉點霉； 生物學(xué)特性

致 謝： 本研究得到浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院李紅葉教授指導(dǎo)與幫助，謹(jǐn)表示衷心的感謝。

聯(lián)系方式E－mail：songmaolu＠163.com

柑橘黑斑病（citrus black spot）是柑橘的一種重要病害，又名柑橘黑星病，在歐盟、美國等地是重要的對外檢疫性有害生物。1895年由Benson［1］最早報道了該病害在澳大利亞新南威爾士州柑橘園的危害，現(xiàn)分布于非洲、亞洲、南美洲等許多國家和地區(qū)，在中國此病主要分布在廣東、福建、浙江、江西、四川、湖南、湖北及臺灣等地區(qū)［2］。該病由柑橘葉點霉［Phyllostictacitricarpa（McAlp.）Van der Aa］引起，有性態(tài)為柑果球座菌（GuignardiacitricarpaKiely）［3－4］，能 侵 染 危 害 金 柚［5］、沙 田 柚［6］、琯 溪 蜜柚［7］、蒼南四季柚［8］、檸檬［9］等多種柑橘類植物的果實、葉片和枝梢，典型癥狀為病斑邊緣呈紅褐色或黑褐色，中部稍凹陷，灰色，散生黑色小粒點（分生孢子器），影響果實的外觀和品質(zhì)。近年來，該病害在全國最大的柚類鮮果生產(chǎn)基地和出口示范基地福建省平和縣［10］琯溪蜜柚種植區(qū)發(fā)生危害形勢日益嚴(yán)峻，果園發(fā)病率在10%～15%，嚴(yán)重的達30%以上，對柚果出口造成嚴(yán)重影響［11］。由于國內(nèi)外尚未見該病原菌生物學(xué)特性系統(tǒng)研究的報道，因此，作者于2010－2011年對該病原菌的生物學(xué)特性進行了系統(tǒng)研究，以期為該病害的預(yù)測預(yù)報及防治提供理論依據(jù)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

柑橘葉點霉［Phyllostictacitricarpa（McAlp.）Van der Aa］由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院李紅葉教授提供。用燕麥培養(yǎng)基（OA）在光暗交替（光照12h、黑暗12h）條件下25℃霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)7d保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 供試培養(yǎng)基［12］

燕麥培養(yǎng)基（OA）：燕麥片30g、瓊脂粉7g、水1L；馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉7g、水1L；PDA＋柚葉汁培養(yǎng)基：馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂粉7g、20g柚葉（磨成汁）、水1L；麥芽膏培養(yǎng)基（MEA）：麥芽膏20g，瓊脂粉7g，水1L；櫻桃汁培養(yǎng)基 （CHA）：櫻桃汁（200mL）、瓊脂粉7g、水1L。將以上培養(yǎng)基分別分裝于三角瓶中，在121℃下滅菌20min后備用。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

在PDA、OA、MEA、CHA、PDA＋柚葉汁培養(yǎng)基平板上，分別接種該病原菌菌絲，在25℃培養(yǎng)箱中光暗交替條件下培養(yǎng)，7d后觀察菌落特征并采用十字交叉法測量菌株菌落大小。每個處理重復(fù)4次。

1.2.2 不同營養(yǎng)液對分生孢子萌發(fā)的影響

分別用0.2%葡萄糖溶液、0.2%α－乳糖溶液、10%柚葉汁和無菌水配制孢子懸浮液，在高倍鏡下每個視野20～30個分生孢子，用移液槍吸取15μL溶液在單凹玻片上，置于25℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，18h后觀察記錄分生孢子萌發(fā)情況。每個處理觀察200個分生孢子，重復(fù)3次。

1.2.3 溫度對菌絲生長和分生孢子萌發(fā)的影響

在PDA培養(yǎng)基平板上，接種菌株菌絲，分別置于10、15、20、22、25、28、30、35、40 ℃霉菌培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)。7d后觀察菌落特征并采用十字交叉法測量菌落大小。每個處理重復(fù)4次。

用pH 6的0.2%葡萄糖溶液配制分生孢子懸浮液，在高倍鏡下每個視野20～30個分生孢子，用移液槍吸取15μL溶液在單凹玻片上，置于15、20、22、25、28、30、35 ℃霉菌培養(yǎng)箱培中保濕培養(yǎng)，24h后觀察記錄分生孢子萌發(fā)情況。每個處理觀察200個分生孢子，重復(fù)3次。

1.2.4 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

分別用1mol／L的鹽酸和氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)滅過菌的 OA培養(yǎng)基的pH 為3、4、5、6、7、8、9、10、11，每個培養(yǎng)皿倒入約15mL培養(yǎng)基，接種病原菌菌絲，置于25℃培養(yǎng)箱中光暗交替培養(yǎng)。7d后觀察菌落特征，并采用十字交叉法測量菌落大小。每個處理重復(fù)4次。

分別用不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10）的0.2%葡萄糖溶液配制分生孢子懸浮液［13］，在高倍鏡下每個視野20～30個分生孢子，用移液槍吸取15μL溶液在單凹玻片上，置于25℃霉菌培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，24h后觀察記錄分生孢子萌發(fā)情況。每個處理觀察200個分生孢子，重復(fù)3次。

1.2.5 光照對菌絲生長的影響

在PDA培養(yǎng)基平板上，接種病原菌菌絲，分別置于25℃培養(yǎng)箱中在完全光照、光暗交替、完全黑暗條件下培養(yǎng)。7d后觀察菌落特征并采用十字交叉法測量菌落大小。每個處理重復(fù)4次。

1.2.6 菌絲、分生孢子致死溫度測定

取未形成子實體的菌絲分裝離心管分別置于45、50、55、60、65℃恒溫水浴鍋中水浴處理10min，再接種至OA平板培養(yǎng)基上置于25℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，7d后觀察菌落生長情況。每個處理重復(fù)4次。

用無菌水配制的孢子懸浮液倒入5個無菌的小試管（每管1mL），分別置于45、50、55、60、65℃的恒溫水浴鍋中水浴處理10min后，再接種至OA平板培養(yǎng)基上，置于霉菌培養(yǎng)箱25℃培養(yǎng)，7d后觀察菌落生長情況。每個處理重復(fù)4次。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基對菌絲生長的影響

5種培養(yǎng)基中，OA培養(yǎng)基上菌落直徑明顯比其他4種大，且菌落顏色明顯帶黃色，其他培養(yǎng)基上則為黑色至灰黑色（圖1）。PDA＋柚葉汁與PDA培養(yǎng)基菌落直徑存在極顯著差異，表明在PDA培養(yǎng)基上添加柚葉汁能促進該菌菌絲生長。PDA和MEA培養(yǎng)基菌落直徑無明顯差異，CHA培養(yǎng)基上最小。病原菌在5種培養(yǎng)基中培養(yǎng)15d后均能產(chǎn)生分生孢子（表1）。

圖1 柑橘葉點霉在不同培養(yǎng)基上的菌落特征

表1 不同培養(yǎng)基對菌絲生長的影響（25℃）1）

2.2 不同培養(yǎng)液對分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在4種營養(yǎng)液中孢子萌發(fā)率均未達到25%以上；在0.2%葡萄糖溶液中孢子萌發(fā)率最高（17%），0.2%α－乳糖溶液和10%柚葉汁液中的萌發(fā)率次之，在水中的萌發(fā)率最低（1%）（圖2）。

2.3 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

病菌菌絲在10～35℃范圍內(nèi)均能生長，菌落顏色由淡黃色變?yōu)榛液谏蚝谏?。?0～25℃范圍內(nèi)，菌絲隨著溫度的升高生長速度逐漸加快。在25～40℃范圍內(nèi)，隨著溫度的升高菌絲生長速度逐漸減慢，40℃時菌絲停止生長。通過方差分析比較，菌絲在25～30℃范圍內(nèi)的生長速率與在其他溫度上的存在極顯著差異，可見最適宜菌絲生長的溫度范圍為25～30℃。低溫（10、15℃）和高溫（40℃）條件下菌落均不產(chǎn)孢，菌絲生長明顯受抑制（表2）。分生孢子在15～35℃范圍內(nèi)均能萌發(fā)，在15～25℃范圍內(nèi)，孢子萌發(fā)率隨溫度升高而逐漸增大，25℃時孢子萌發(fā)率最大。在25～35℃范圍內(nèi)，孢子萌發(fā)率隨溫度升高而逐漸減小（圖3）。

圖2 培養(yǎng)液對分生孢子萌發(fā)的影響

2.4 pH對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響

菌絲在pH4～11范圍都能生長，但在pH3時不能生長。結(jié)果分析表明，菌絲在pH5～7條件下的生長速率與其他pH上的存在極顯著差異，可見最適宜菌絲生長的pH為5～7。在pH4～11范圍內(nèi)，培養(yǎng)7d后的菌落顏色隨著pH的增大由黑色逐漸變?yōu)辄S色。菌絲生長16d后均能產(chǎn)孢，但pH11的產(chǎn)孢最少（表3）。分生孢子在pH3～9范圍內(nèi)均能萌發(fā)，但pH10時不能萌發(fā)。

在pH3～6范圍內(nèi)，隨著pH的增大孢子萌發(fā)率逐漸升高，到pH6時最高。在pH6～10范圍內(nèi)，隨著pH增大，孢子萌發(fā)率逐漸降低（圖4）。

圖3 溫度對分生孢子萌發(fā)的影響

表2 溫度對菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響（PDA）1）

表3 pH對菌絲生長的影響（OA，25℃）1）

2.5 光照對菌絲生長的影響

菌絲在12h光暗交替條件下生長最快，全光照生長次之，全黑暗生長最慢，但菌落顏色、菌落形態(tài)和產(chǎn)孢情況在3種處理中大致相同（表4）。

圖4 pH對分生孢子萌發(fā)的影響

表4 光照對菌絲生長的影響（PDA，25℃）1）

2.6 菌絲、分生孢子致死溫度測定

該病原菌菌絲和分生孢子經(jīng)55℃以上水浴處理10min后，再轉(zhuǎn)移至OA培養(yǎng)基上25℃下培養(yǎng)7d，均未見菌絲生長和菌落形成，而在45、50℃水浴處理10min后的菌絲和分生孢子仍具有活性（培養(yǎng)7d后可見菌絲生長），由此表明55℃水浴處理該菌菌絲和分生孢子10min可使其失活。

3 結(jié)論與討論

本文系統(tǒng)研究了培養(yǎng)基、營養(yǎng)液、溫度、pH和光照對柑橘葉點霉菌絲生長、分生孢子形成和分生孢子萌發(fā)的影響。研究結(jié)果表明，柑橘葉點霉菌絲在不同培養(yǎng)基上生長，其菌落特征有差異，在OA培養(yǎng)基上菌落為黃色至黃黑色，而其他4種培養(yǎng)基上菌落顏色均未見黃色，這與Baldassri［14］研究報道一致，同時，Baldassri還指出利用OA培養(yǎng)基能有效地從形態(tài)特征鑒別Guignardiacitricarpa和Guignardiamangiferae。然而，Baayen［15］研究認為，菌絲除了在OA生長會出現(xiàn)黃色外，在CHA和MEA上生長均可見淡黃色，這可能與不同菌株和培養(yǎng)條件有關(guān)。

菌絲能在較寬的溫度范圍（10～35℃）和pH范圍（4～11）生長，表明該菌可能在自然條件下的適應(yīng)性較強。Wager［16］研究認為菌絲在瓊脂培養(yǎng)基上最適生長溫度為24～27℃，這與筆者的研究結(jié)果較為吻合。在10℃時，菌絲生長明顯受到抑制，與Agostini［17］的研究結(jié)果一致，進一步說明了果實采收后低溫儲藏能減緩果實病斑的發(fā)展。光照對菌絲生長也有影響，12h光暗交替條件最有利于菌絲生長，這表明田間向陽的果實或葉片可能更有利于病菌的生長。分生孢子萌發(fā)試驗表明，該菌的分生孢子萌發(fā)率低，以在pH6的0.2%葡萄糖溶液中25℃下萌發(fā)最好，但Kiely［18］研究認為0.3%橘汁最適合分生孢子萌發(fā)，這可能與不同地區(qū)分生孢子特征及萌發(fā)營養(yǎng)液差異有關(guān)。

柑橘黑斑病是一種潛伏期很長的病害，從病原菌侵染成功到果實或葉片表現(xiàn)癥狀需要很長的時間。Baldassari［19］報道甜橘在人工接種成功后至少要55d才能初顯發(fā)病癥狀。一旦病原菌侵入果實后，在果實成熟期病斑會大量出現(xiàn)，將給果農(nóng)帶來巨大的損失。Agostini提出了果實生長季節(jié)的化學(xué)防治措施和8℃的儲藏溫度能有效減少果實病斑的出現(xiàn)。因此，在生產(chǎn)實踐中，應(yīng)結(jié)合病原菌的生物學(xué)特性，做好果實前期的病害預(yù)防工作，減少病源；在果實采收后，應(yīng)注意保存的條件。目前，國內(nèi)外有關(guān)柑橘黑斑病菌潛伏侵染機制尚不明確，有待今后進一步研究。

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Biological characteristics of the pathogen of citrus black spot

Lu Songmao， Luo Jinshui， Zhang Hanrong， Yu Zhicheng， Lin Zhiming， Lin Xiuxiang
（FujianInstituteofTropicalCrops，Zhangzhou363001，China）

The effects of different media，temperatures，pH and lights on mycelial growth and conidial germination were tested to understand the biological characteristics ofPhyllostictacitricarpa（McAlp.）Van der Aa causing the citrus black spot.The results showed that the optimum medium for mycelial growth was oatmeal agar（OA）.For mycelial growth，the optimum temperature was 25－30℃，and the optimum pH was 5－7.It grew the fastest under alternate light and darkness every 12 hours，but the slowest in darkness.The optimum temperature for conidial germination was 25℃，and the optimum pH was 6.If the conidia grew in0.2%glucose solutions，the percentage of conidial germination was the highest.The lethal temperature for the conidium and mycelium was 55℃，lasting for 10 minutes.

citrus black spot；Phyllostictacitricarpa； biological characteristics

S 436.661.1

A

10.3969／j.issn.0529－1542.2012.05.009

2012－01－31

2012－02－29

福建省公益類基本科研專項（2009R10010－1）；福建省自然科學(xué)基金項目（2010J01113）