黃橋華 劉心強(qiáng) 邱倩

缺血-再灌注損傷已經(jīng)成為威脅人類生命的一個(gè)病理生理改變而越來(lái)越受到研究者的關(guān)注。心肌細(xì)胞凋亡是缺血-再灌注損傷的重要表現(xiàn)形式，尤其在缺血-再灌注早期，心肌細(xì)胞凋亡作用更為明顯。多年來(lái)，研究各種藥物對(duì)缺血-再灌注損傷及心肌細(xì)胞凋亡的影響一直是科研熱點(diǎn)，也是此領(lǐng)域急需解決的課題之一。因此尋找有效的藥物來(lái)抑制細(xì)胞凋亡對(duì)防治心肌缺血-再灌注損傷具有重要意義。本研究通過(guò)建立乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，使用茜草雙酯的干預(yù)，探討茜草雙酯對(duì)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)出生1～3 d的Sprague-Dawley(SD)大鼠的乳鼠，雌雄不限，由贛南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 茜草雙酯購(gòu)自上海第二制藥廠，DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、5-溴脫氧尿嘧啶(5-BrdU)購(gòu)自Sigma公司，胎牛血清(南美產(chǎn))購(gòu)自Hyclone公司，乳酸脫氫酶(LDH)檢測(cè)試劑盒、丙二醇(MDA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，細(xì)胞凋亡和壞死檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

1.2.1 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng) 出生1～3 d的SD大鼠的乳鼠，消毒后取心臟，剪碎后用0.08%的胰蛋白酶消化液消化，用含15%胎牛血清的高糖DMEM終止消化，離心后重懸細(xì)胞，吹打均勻后經(jīng)200目細(xì)胞篩濾去細(xì)胞團(tuán)和未消化的組織塊，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度約5×105個(gè)/ml，接種至培養(yǎng)瓶中，差速貼壁法分離心肌細(xì)胞，加入0.1 mmol/L的BrdU純化心肌細(xì)胞，放入37℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h更換培養(yǎng)基，之后根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況1～2 d更換培養(yǎng)基。

1.2.2 心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型建立 參照文獻(xiàn)［1］方法，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室裝置建立缺氧復(fù)氧模型:在原代心肌細(xì)胞中換入無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基孵育12 h。快速換入經(jīng)95%N2～5%CO2混合氣平衡的低糖無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基，并迅速移入該種混合氣充分平衡的單向氣流缺氧裝置中，持續(xù)通入95%N2～5%CO2混合氣。細(xì)胞缺氧4 h后迅速換入無(wú)血清高糖DMEM培養(yǎng)基，并放入95%O2～5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。使心肌細(xì)胞遭受缺氧/復(fù)氧損傷。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)3～4 d后，細(xì)胞生長(zhǎng)融合且同步搏動(dòng)良好時(shí)分為:①正常對(duì)照組;②缺氧/復(fù)氧模型預(yù)先加茜草組;③缺氧/復(fù)氧模型組。

1.2.4 細(xì)胞上清LDH、MDA測(cè)定 收集各組細(xì)胞上清，用LDH、MDA試劑盒檢測(cè)上清的上述反應(yīng)細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)。

1.2.5 細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè) 使用Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)雙染的方法檢測(cè)，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 14.0 for Windows軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，選擇重復(fù)測(cè)量的方差分析過(guò)程，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞上清LDH、MDA測(cè)定結(jié)果比較 三組比較發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組LDH活性和MDA含量最低，缺氧/復(fù)氧模型預(yù)先加茜草組和缺氧/復(fù)氧模型組LDH活性和MDA含量明顯升高(P＜0.01);缺氧/復(fù)氧模型預(yù)先加茜草組和缺氧/復(fù)氧模型組比較發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧模型預(yù)先加茜草組較缺氧/復(fù)氧模型組LDH活性和MDA含量降低有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見表1)。

表1 各組細(xì)胞上清LDH活性和MDA含量比較(±s)

表1 各組細(xì)胞上清LDH活性和MDA含量比較(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，(1)P＜0.01;與缺氧/復(fù)氧模型組比較，(2)P＜0.05

LDH活性(U/L) MDA含量(nmol/L)17.96±2.01 1.07±0.29缺氧/復(fù)氧模型預(yù)先加茜草組 62.59±6.09(1)(2) 1.77±0.34(1)(2)缺氧/復(fù)氧模型組 116.15±5.77(1) 2.29±0.27(1)正常對(duì)照組

2.2 細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)結(jié)果 在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常對(duì)照組中細(xì)胞凋亡和壞死不明顯，而缺氧/復(fù)氧模型預(yù)先加茜草組和缺氧/復(fù)氧模型組有不同程度的細(xì)胞凋亡和壞死。與缺氧/復(fù)氧模型組比較，缺氧/復(fù)氧模型預(yù)先加茜草組細(xì)胞凋亡和壞死有所減少(見圖1～3)。

圖2 缺氧/復(fù)氧模型預(yù)先加茜草雙酯組

圖1 正常對(duì)照組

圖3 缺氧/復(fù)氧模型組

3 討論

缺血-再灌注損傷是心肌組織壞死的常見原因，而細(xì)胞凋亡是其發(fā)病機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)之一［1］。缺血-再灌注損傷的機(jī)制尚未完全闡明，目前認(rèn)為I/R損傷的基礎(chǔ)是細(xì)胞能量代謝障礙。心臟是一個(gè)高耗能的器官，維持其正常的生理功能需要大量的能量供應(yīng)，而心肌能量代謝障礙是缺血-再灌注損傷的始動(dòng)環(huán)節(jié)［2］。并認(rèn)為其可能與缺氧/復(fù)氧后自由基釋放增加、鈣離子超載及線粒體損傷等變化有密切關(guān)系［3-6］。茜草雙酯是人工合成的萘酚化合物［6］，茜草雙酯在臨床上常用于升高白細(xì)胞作用［7，8］。目前有研究表明，茜草雙酯對(duì)缺血心肌有抗氧化作用［9］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型，給予茜草雙酯預(yù)處理，分別測(cè)各組細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)活性、丙二醛(MDA)含量及細(xì)胞的凋亡與壞死，發(fā)現(xiàn)茜草雙酯對(duì)體外培養(yǎng)的缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞具有保護(hù)和抗凋亡作用。

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