王珅 方志強

肝硬化(hepatic cirrhosis，HC)發(fā)展過程中常伴隨腸黏膜屏障的損傷［1］，腸道內(nèi)大量細(xì)菌向腸腔外移位，可引起全身炎性反應(yīng)綜合征和多器官功能衰竭［2］。因此，重建腸道屏障的完整性在肝硬化治療中顯得尤為重要。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)是血紅素代謝中的限速酶，炎癥等刺激可誘導(dǎo)其表達(dá)，具有細(xì)胞保護(hù)作用［3］。本實驗通過建立四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)致大鼠肝硬化動物模型，觀察HO-1誘導(dǎo)對腸黏膜屏障的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 試劑 FITC-葡聚糖、鈷原卟啉(cobalt protoporphyrin，CoPP)(Sigma公司);小鼠抗大鼠Bcl-2一抗及山羊抗小鼠二抗(Santa Cruz公司);小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司);ELISA試劑盒(BioSource公司);BCA蛋白濃度測定試劑盒、脂質(zhì)氧化(MDA)檢測試劑盒及TUNEL試劑盒(碧云天公司)。

1.2 肝硬化動物模型的建立 建立肝硬化動物模型的方法參照文獻(xiàn)［4］，簡述如下:選取健康雄性 Wistar大鼠40只(山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)，體重210～240 g，隨機分為2組:control組(n=8):以正常飲食喂養(yǎng);HC組(n=32):建模第一天，大鼠背部皮下注射CCl4原液(5 ml/kg)。以后每隔3日，皮下注射40%的CCl4橄欖油溶液(3 ml/kg)。飼料前兩周為79.5%玉米面、20%豬油及0.5%膽固醇，從第三周起為99.5%玉米面與0.5%膽固醇，10～30%飲用酒為其唯一飲用水。六周末可形成HC。建模中HC組病死率為34.4%(11/32)，對照組無死亡。

1.3 誘導(dǎo)HO-1表達(dá) 在HC組中隨機選取10只大鼠誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，為HC+HO組。實驗方法參照文獻(xiàn)［5］，簡述如下:HC+HO組大鼠每周兩次皮下注射CoPP(1.5 mg/kg)，共兩周。作為對照，control組與HC組均注射NaOH溶液(0.1 mol/L，pH 8.3)。

1.4 腸黏膜通透性檢測 將大鼠麻醉后開腹手術(shù)，仔細(xì)分離出距回盲瓣5 cm處的下段回腸10 cm，兩端以棉線扎緊。將濃度為2 g/L的FITC-葡聚糖注入該腸段至充盈。30 min后取門靜脈血1 mL、分離血漿。多功能酶標(biāo)儀檢測血漿中的熒光強度(激發(fā)光488 nm，發(fā)射光525 nm)。如測定值超過檢測上限，可同比例稀釋樣本。以各組測定值與control組的平均熒光強度之比作為反映腸黏膜通透性的相對指標(biāo)。

1.5 血漿及腸組織勻漿生化指標(biāo)的檢測 經(jīng)腹主動脈取血，分離、分裝血漿并凍存于-80℃待檢。同時取一段回腸組織制備組織勻漿，4℃ 12500 g超速離心10 min后收集上清液。檢測上清液中回腸組織蛋白濃度(BCA法)。ELISA法檢測血漿腫瘤壞死因子(tumour necrosis factor α，TNF-α)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)含量。脂質(zhì)氧化檢測試劑盒檢測腸組織勻漿丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量。

1.6 回腸組織HO活性的測定 以膽紅素生成量反映大鼠回腸組織HO的活性，方法參照文獻(xiàn)［6］，并略作修改。將一定蛋白含量的回腸組織勻漿上清液加入體積為1.2 mL的反應(yīng)體系，其中包含:大鼠肝細(xì)胞溶質(zhì)(2 mg)、NADP(0.8 mmol/L)、6-磷酸葡萄糖(1 mmol/L)和6-磷酸葡萄糖脫氫酶(0.2單位)。最后添加20 μL氯高鐵血紅素(2.5 mmol/L)作為酶反應(yīng)底物。37℃水浴避光反應(yīng)20 min，置于冰上終止反應(yīng)。用多功能酶標(biāo)儀在于464 nm和530 nm處測定吸光度。膽紅素濃度c=(A464-A530)/εb。式中ε=40(mmol L-1)-1 cm-1，為膽紅素的吸光系數(shù);b為光程長度(cm)。HO活性表示為每mg組織蛋白在1 h內(nèi)催化生成的膽紅素的量。

1.7 腸黏膜凋亡細(xì)胞原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測 10%甲醛固定回腸末端組織(應(yīng)避開做通透性檢測的腸段)，石蠟包埋、切片、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后，蛋白酶K(20 mg/L)37℃孵育30 min。PBS沖洗2 min ×3次，3%H2O2甲醇室溫封閉30 min。PBS洗片后加入TUNEL反應(yīng)液50 μL/張切片，37℃避光孵育1 h。PBS洗片2 min ×3次，加入 POD 50 μL，37℃孵育30 min。PBS洗片2 min×3 次，DAB顯色10 min，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。實驗重復(fù)3次。

1.8 Western blot 將含20 μg蛋白的回腸組織勻漿上清液上樣于15%的SDS-PAGE，電泳分離，之后將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。用小鼠抗大鼠Bcl-2單克隆抗體檢測。以β-actin為內(nèi)參。實驗結(jié)果以同一樣本Bcl-2蛋白與β-actin蛋白表達(dá)量的比值表示。實驗重復(fù)3次。

2 實驗結(jié)果

2.1 腸組織HO活性的變化 為確定HC大鼠HO-1的誘導(dǎo)情況，我們檢測了各組大鼠腸組織HO的活性。結(jié)果顯示，與control組相比，HC組大鼠腸組織HO活性即顯著升高(P＜0.01);經(jīng)CoPP誘導(dǎo)后，HC+HO組大鼠腸組織HO活性顯著高于HC組(P＜0.01，圖1)。

圖1 各組大鼠腸組織HO活性的變化

2.2 誘導(dǎo)HO-1對肝硬化大鼠腸黏膜通透性的影響 如圖2所示，與control組比較，HC組大鼠腸道通透性顯著增高(P＜0.01)，相對熒光強度達(dá)到前者的3倍左右。經(jīng)HO-1誘導(dǎo)后，HC+HO組大鼠腸道通透性比HC組顯著降低(P＜0.05)。

圖2 誘導(dǎo)HO-1對肝硬化大鼠腸道通透性的影響

2.3 各組血漿TNF-α及IL-6與腸組織勻漿MDA含量的變化 血漿 TNF-α水平在 HC組顯著高于control組(P＜0.01)，而在HC+HO組顯著低于HC組(P＜0.05);IL-6水平在HC組顯著高于control組(P＜0.01)，但在HC與HC+HO兩組間未見顯著性差異。腸組織勻漿MDA含量在HC組顯著高于control組(P＜0.01)，而在HC+HO組顯著低于HC組(P＜0.01)，見表1。

表1 各組血漿TNF-α及IL-6與腸組織勻漿MDA的含量

2.4 誘導(dǎo)HO-1對肝硬化大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡的影響Control組大鼠腸黏膜上皮凋亡細(xì)胞數(shù)量很少(圖3A)，而HC組可見大量腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡，固有層和腺上皮細(xì)胞亦可見凋亡，陽性細(xì)胞呈棕黃色(圖3B)。誘導(dǎo)大鼠表達(dá)HO-1后，腸黏膜凋亡細(xì)胞數(shù)明顯減少(圖3C)。

圖3 誘導(dǎo)HO-1減輕肝硬化大鼠腸上皮細(xì)胞凋亡

2.5 誘導(dǎo)HO-1對肝硬化大鼠腸組織Bcl-2表達(dá)的影響HC組大鼠Bcl-2蛋白表達(dá)量為0.05±0.02，顯著低于control組的0.22±0.17(P＜0.01)。而誘導(dǎo)HO-1可使肝硬化大鼠回腸Bcl-2蛋白表達(dá)量升高至0.58±0.24(P＜0.01)，已顯著高于control組(P＜0.01)(圖4)。

圖4 誘導(dǎo)HO-1上調(diào)肝硬化大鼠腸組織Bcl-2表達(dá)

3 討論

肝纖維化肝硬化時腸黏膜通透性增加可導(dǎo)致細(xì)菌向腸外移位、內(nèi)毒素血癥形成及自發(fā)性腹膜炎的產(chǎn)生［7］。腸源性內(nèi)毒素血癥的形成可激活Kupffer細(xì)胞合成與釋放炎性介質(zhì)如TNF-α等進(jìn)一步損傷腸屏障功能［8］。內(nèi)毒素血癥還對肝臟造成“二次打擊”［9］，誘發(fā)炎性介質(zhì)大量釋放，繼而反復(fù)、持續(xù)地?fù)p傷肝細(xì)胞。因此，在肝硬化治療中應(yīng)以重建腸屏障完整性、防止內(nèi)毒素血癥形成為重要策略。

HO系統(tǒng)具有顯著的抗炎、抗氧化等細(xì)胞保護(hù)作用［10］。HO是血紅素代謝的關(guān)鍵酶，催化其降解產(chǎn)生膽紅素、一氧化碳(carbon monoxide，CO)和鐵。在哺乳動物中存在兩種HO同工酶［5］，即 HO-1和 HO-2。HO-1可在氧化應(yīng)激、輻射、炎癥及低氧等刺激下被誘導(dǎo)表達(dá)［11］。本研究以CoPP皮下注射誘導(dǎo)大鼠表達(dá)HO-1。有資料表明CoPP不會影響HO-2的表達(dá)量［5］，故本研究檢測腸組織HO活性即可顯示HO-1表達(dá)量的變化。

我們的研究結(jié)果顯示，與對照組相比，肝硬化大鼠腸黏膜通透性顯著增高;誘導(dǎo)大鼠表達(dá)HO-1可顯著降低肝硬化大鼠腸黏膜的通透性。為探討HO-1對大鼠腸屏障的保護(hù)機制，我們首先考慮其抗炎作用是否參與其中。通過對血漿炎癥因子TNF-α及IL-6的檢測，發(fā)現(xiàn)在肝硬化大鼠中這兩種細(xì)胞因子血漿含量均顯著高于對照組，說明在纖維化形成過程中炎癥介質(zhì)的釋放可能參與了對肝、腸的損傷。誘導(dǎo)HO-1表達(dá)可顯著降低肝硬化大鼠血漿TNF-α水平。同時結(jié)合對腸組織勻漿MDA的檢測，發(fā)現(xiàn)HO-1誘導(dǎo)可降低肝硬化大鼠腸MDA水平。說明HO-1可使大鼠體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度降低，間接反映出其對腸組織損傷的保護(hù)作用。

細(xì)胞凋亡常常也是導(dǎo)致上皮組織緊密連接破壞、通透性增高的重要原因［12］。本研究發(fā)現(xiàn)肝硬化大鼠腸黏膜凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組，說明細(xì)胞凋亡可能參與了肝硬化大鼠腸黏膜通透性的升高。誘導(dǎo)HO-1表達(dá)可降低肝硬化大鼠腸黏膜細(xì)胞凋亡。我們還考察了抗凋亡蛋白Bcl-2在各組中的表達(dá)情況。肝硬化大鼠腸組織Bcl-2表達(dá)低于對照組，但其在HO-1誘導(dǎo)之后表達(dá)水平明顯增加，這可能是腸黏膜細(xì)胞凋亡減少的關(guān)鍵信號。

最近在對小鼠肝臟缺血/再灌注模型的研究中發(fā)現(xiàn)［13］，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)可增加信號蛋白STAT3的磷酸化，后者激活PI3K/Akt通路、降低缺血再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。誘導(dǎo)HO-1保護(hù)肝硬化大鼠腸黏膜屏障的分子機制值得在今后的研究中進(jìn)一步探討。

［1］Palma P，Mihaljevic N，Hasenberg T，et al.Intestinal barrier dysfunction in developing liver cirrhosis:An in vivo analysis of bacterial translocation.Hepatol Res，2007，37(1):6-12.

［2］Shawcross DL，Sharifi Y，Canavan JB，et al.Infection and systemic inflammation，not ammonia，are associated with Grade 3/4 hepatic encephalopathy，but not mortality in cirrhosis .J Hepatol，2011，54(4):640-649.

［3］Piantadosi CA，Withers CM，Bartz RR，et al.Heme oxygenase-1 couples activation of mitochondrial biogenesis to anti-inflammatory cytokine expression . JBiolChem，2011，286(18):16374-16385.

［4］韓德五，馬學(xué)惠，趙元昌.肝硬化動物模型的研究 .山西醫(yī)藥雜志，1979，8(4):1.

［5］Elmarakby AA，F(xiàn)aulkner J，Posey SP，et al.Induction of hemeoxygenase-1 attenuates the hypertension and renal inflammation in spontaneously hypertensive rats.Pharmacol Res，2010，62(5):400-407.

［6］Morita T，Perrella MA，Lee ME，et al.Smooth muscle cell-derived carbon monoxide is a regulator of vascular cGMP.Proc Natl Acad Sci U S A，1995，92(5):1475-1479.

［7］Lorenzo-Zuniga V，Rodriguez-Ortigosa CM，Bartoli R，et al.Insulin-like growth factor I improves intestinal barrier function in cirrhotic rats .Gut，2006，55(9):1306-1312.

［8］Genesca J，Marti R，Rojo F，et al.Increased tumour necrosis factor alpha production in mesenteric lymph nodes of cirrhotic patients with ascites.Gut，2003，52(7):1054-1059.

［9］Han DW Intestinal endotoxemia as a pathogenetic mechanism in liver failure.World J Gastroenterol，2002，8(6):961-965.

［10］Krause D，Suh HS，Tarassishin L，et al.The tryptophan metabolite 3-hydroxyanthranilic Acid plays anti-inflammatory and neuroprotective roles during inflammation role of hemeoxygenase-1.Am J Pathol，2011，179(3):1360-1372.

［11］Otterbein LE，Hedblom A，Harris C，et al.Heme oxygenase-1 and carbon monoxide modulate DNA repair through ataxia-telangiectasia mutated(ATM)protein.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108(35):14491-14496.

［12］Syrkina O，Jafari B，Hales CA，et al.Oxidant stress mediates inflammation and apoptosis in ventilator-induced lung injury.Respirology，2008，13(3):333-340.

［13］Ke B，Shen XD，Ji H，et al.HO-1-Stat3 axis in mouse liver ischemia/reperfusion injury:regulation of TLR4 innate responses through PI3K/PTEN signaling.J Hepatol，2011.