鐘 華,胡清華,王恩幫,司軍強(qiáng),孫志萍,李增春,何 芳△

(1.新疆地方病與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實驗室,2.石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室,3.生理教研室,4.醫(yī)學(xué)機(jī)能實驗中心,石河子832002;5.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)系,衛(wèi)生部呼吸系統(tǒng)疾病重點(diǎn)實驗室,湖北 武漢 430030)

血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)增殖、遷移和表型的變化導(dǎo)致的血管壁增厚和血管緊張度的增加是高血壓發(fā)病的關(guān)鍵。由縫隙連接蛋白(connexin,Cx)構(gòu)成的直接通訊-縫隙連接(gap junction,GJ)在調(diào)節(jié)血管舒縮、血管平滑肌細(xì)胞增殖、平滑肌的表型轉(zhuǎn)變中起著重要作用,并與高血壓發(fā)生密切相關(guān)[1]。我們及其他學(xué)者前期的研究發(fā)現(xiàn)同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血漿水平升高使人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)活性減弱、一氧化氮(nitric oxide,NO)含量降低,并削弱了NO的血管舒張作用,增加氧化應(yīng)激,刺激血管平滑肌細(xì)胞增生,改變血管壁彈性,增加血管阻力,因此促成血壓升高[2,3],GJ是否參與了Hcy介導(dǎo)的高血壓大鼠VSMCs增殖效應(yīng)尚不清楚。因此本文以體外培養(yǎng)自發(fā)性高血壓大鼠VSMCs為研究對象,初步探討了縫隙連接在Hcy介導(dǎo)的SHR血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用及分子機(jī)制,為高血壓的防治提供新靶標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 3～10周齡,150～200 g自發(fā)性高血壓大鼠(購自北京維通利華實驗動物有限責(zé)任公司,許可證編號SCXK京2007-0001),雌雄不限。

1.1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(Gibco),胎牛血清/小牛血清(Hyclone),胰蛋白酶(Sigma),Hcy(Sigma),18α-GA(Sigma),抗 а-Actin 單克隆抗體(Dako),抗Cx40單克隆抗體(Invitrogen),抗Cx43單克隆抗體(Invitrogen),羅氏黃(Molecular probes),羅丹明-葡聚糖(Molecular probes),發(fā)光試劑盒(Pierce)

1.2 方法

1.2.1 VSMCs的培養(yǎng)和鑒定 取3～10周齡,150～200 g自發(fā)性高血壓大鼠,雌雄不限,斷頭處死。無菌條件下取胸主動脈,以貼塊法培養(yǎng)VSMC,細(xì)胞生長融合后,用0.25%的胰蛋白酶消化,以105～106cells/ml的密度傳代培養(yǎng),對細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并對細(xì)胞內(nèi)平滑肌肌動蛋白α-Actin進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色,95%以上的細(xì)胞呈陽性著色,證實細(xì)胞為VSMC。取3～5代細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組 將細(xì)胞以5×104cells/ml的密度培養(yǎng)24 h后吸去孔內(nèi)液體,加入無血清培養(yǎng)基,24 h后再次吸去孔內(nèi)液體,按以下分組加入試劑:(1)對照組:加含10%FBS的DMEM;(2)Hcy組:加含Hcy濃度為0.05 mmol/L的含10%FBS的DMEM;(3)縫隙連接阻斷劑組:加含18α-GA 濃度為50 μ mol/ml的含10%FBS的DMEM;(4)Hcy+縫隙連接阻斷劑組:加含Hcy和18α-GA的濃度分別為0.05 mmol/L和 50 μ mol/ml的含 10%FBS的 DMEM。

1.2.3 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測Cx40、Cx43在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及共定位 按實驗分組制作細(xì)胞爬片,用PBS洗三遍,4%預(yù)冷的多聚甲醛固定20 min后用含0.2%Triton的PBS液洗三遍,0.2%Triton X-100室溫透膜30 min,含0.2%Triton的PBS洗三遍,血清封閉30 min,含0.2%Triton的PBS洗三遍,加入一抗Cx40(1∶100)、Cx43(1∶50)4℃濕盒內(nèi)過夜,含0.2%Triton的PBS洗三遍后,加入FITC標(biāo)記二抗(1∶50);羅丹明TRITC標(biāo)記二抗(1∶50),室溫避光孵育2 h,含0.2%Triton的PBS沖洗3次,加核染料DAPI(1∶1 000)室溫避光孵育15 min,含0.2%Triton的PBS洗三遍,60%緩沖甘油封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.2.4 MTT法檢測VSMCs的增殖活性 制備細(xì)胞懸液,用含10%FBS的DMEM液稀釋成5×104cells/ml,接種于 96孔板 ,每孔加入 200 μ l混勻后的細(xì)胞懸液,置于37℃,5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。棄去培養(yǎng)液,用PBS液沖洗1～2遍。每孔加入不含F(xiàn)BS的DMEM 液 ,各200 μ l,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,使細(xì)胞同步于G0/G1期。棄去培養(yǎng)液,分別按實驗分組加入試劑,每組8個復(fù)孔,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24 h后,各組棄去培養(yǎng)液,每孔加入MTT 20 μ l,孵育 4 h,加入DMSO 150 μ l,于酶標(biāo)儀上檢測各孔570 nm處吸光度(A值)。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 在六孔板內(nèi)各組試劑作用24 h后吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基,PBS沖洗兩次,離心后,棄上清液加PBS液吹打均勻,離心,重復(fù)2次棄上清液加PBS液吹打均勻,然后加入70%酒精4℃過夜,至少18 h,離心后,加PBS重懸離心同上,重復(fù)2次后,加碘化丙錠(propidium iodide,PI)染液0.5 ml,置于4℃,30 min后上流式細(xì)胞儀,重復(fù)4次,進(jìn)行細(xì)胞周期測定,通過特殊軟件計算S期的百分率,以S值反映細(xì)胞增殖能力。

1.2.6 Western blot法檢測SHR VSMCs內(nèi)Cx40、Cx43蛋白表達(dá) 在六孔板內(nèi)各組試劑作用24 h后吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基,預(yù)冷PBS沖洗3次,加入細(xì)胞裂解液200 μ l,吹打 ,轉(zhuǎn)入 1.5 ml EP 管中,保持 冰上 30 min后4℃離心,取上清用5×加樣緩沖液稀釋,煮沸6～8 min,BCA法測蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行蛋白質(zhì)定量,-20℃保存。所有實驗均獨(dú)立重復(fù)3次。以上蛋白樣品(30 μ g)經(jīng)10%聚丙烯凝膠電泳分離后,恒壓25 V電轉(zhuǎn)移50 min到硝酸纖維素濾膜(NC)上,然后封閉緩沖液(5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白)中封閉1 h。將膜放入用5%封閉液稀釋的第一抗體(Cx43稀釋比例為1∶1 000;Cx40稀釋比例為 1∶200)中,在室溫下孵育,持續(xù)搖動 2 h。1×TBST(10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.4,150 mmol/L氯化鈉,0.05%Tween-20)洗膜,將膜用封閉緩沖液稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的第二抗體(1∶2 000稀釋),室溫作用2 h,1×TBST洗膜,新鮮配制的ECL顯色液1 ml(A、B液等體積混勻)和膜孵育1 min,封入保鮮膜中,壓片,顯影于感光膠片上。將經(jīng)以上處理的NC膜用洗脫緩沖液(strip buffer)室溫孵育1 h后,洗膜3次,每次15 min。用β-actin內(nèi)參抗體(1∶1 000)室溫孵育2h,以同樣方法顯影于感光膠片。用Bandleader 3.0軟件對條帶進(jìn)行灰度掃描,按下述公式分別計算三次實驗中樣品蛋白的相對含量:蛋白相對含量(該蛋白條帶的灰度值-背景的灰度值)/(對照條帶的灰度值-背景的灰度值),以此比值計算均數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)差。

1.2.7 染料示蹤分子傳遞法(劃痕標(biāo)記染料傳輸法)檢測血管平滑肌細(xì)胞間縫隙連接功能 在六孔板內(nèi)各組試劑作用24 h后吸凈孔內(nèi)培養(yǎng)基,以37℃預(yù)溫的PBS沖洗細(xì)胞3次,加熒光染料0.05%羅氏黃(Lucifer yellow,LY)和 0.05%羅丹明-葡聚糖1∶1混合液,每孔1 ml,用銳利的外科手術(shù)刀在細(xì)胞表面上劃痕數(shù)條并計時,孵育3 min吸出熒光染料,PBS沖洗細(xì)胞3次,然后加入少量PBS以剛好覆蓋細(xì)胞為宜,熒光顯微鏡下觀察,羅氏黃熒光的顯示用FITC系統(tǒng)的濾光片,羅丹明-葡聚糖用羅丹明系統(tǒng)濾光片,LY熒光染料傳遞百分?jǐn)?shù)=LY熒光陽性細(xì)胞數(shù)(劃痕細(xì)胞外)/劃痕標(biāo)記的細(xì)胞(即RD+LY陽性細(xì)胞數(shù)),重復(fù)實驗3次,統(tǒng)計分析后,以此代表縫隙連接功能的強(qiáng)弱。其大小代表細(xì)胞間縫隙連接通訊功能強(qiáng)弱。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 免疫熒光技術(shù)檢測SHR VSMCs中Cx43與Cx40蛋白的表達(dá)及兩者的共定位

共聚焦熒光顯微鏡下觀察,綠色熒光為Cx43的陽性著色,主要定位于胞漿,紅色熒光為Cx40的陽性著色,主要定位于胞漿與胞膜,橙色熒光為兩者的合成熒光,主要定位于胞漿,藍(lán)色熒光顯示為細(xì)胞核的DNA染料(DAPI)陽性著色,可見SHR VSMCs中Cx43與Cx40蛋白表達(dá)呈陽性,兩者共定位于胞漿(圖1)。

Fig.1 Expression and co-localization of the Cx43 and Cx40 proteins in the SHR VSMCs by confocal microscopy(FITC,TRITC,DAPI,confocal microscopy×40)

2.2 VSMCs的增殖

2.2.1 各實驗組VSMCs的增殖活性 結(jié)果顯示:與control組相比,Hcy組的A值增高(P＜0.05),VSMCs增殖活性增加,縫隙連接阻斷劑(18α-GA)組的A值降低(P＜0.05),VSMCs增殖活性減少,Hcy+18α-GA組A值無明顯差異(P＞0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA組A值明顯降低(P＜0.05),VSMCs增殖活性減少(表1)。

Tab.1 A value of different groups in SHR VSMCs by MTT(±s,n=10)

Tab.1 A value of different groups in SHR VSMCs by MTT(±s,n=10)

Hcy:Homocysteine;GA:Glycyrrhetinic acid;SHR:Spontaneously hypertention rat;VSMC:Vascular smooth muscle cell*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Hcy group

Group A570 Control 0.34±0.04 Hcy 0.44±0.04*18α-GA 0.27±0.02*#Hcy+18α-GA 0.32±0.05#

2.2.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期 與control組相比,Hcy組S值增高(P＜0.05),VSMCs增殖能力增加,18α-GA組S值降低(P＜0.05),VSMCs增殖能力減弱,Hcy+18α-GA組 S值無顯著性差異(P＞0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA 組S值明顯降低(P＜0.05),VSMCs增殖能力減弱(圖2,表2)。

Fig.2 PI atlas of cell cycle in SHR VSMCs from different groups A:Control group;B:Hcy group;C:18α-GA group;D:Hcy+18α-GA group;PI:Propidium iodide

Tab.2 Percentage of speriod in cell cycle in SHR VSMCs of different groups(±s,n=4)

Tab.2 Percentage of speriod in cell cycle in SHR VSMCs of different groups(±s,n=4)

Hcy:Homocysteine;GA:Glycyrrhetinic acid;SHR:Spon taneously hypertensive rat;VSMC:Vascular smooth muscle cell*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Hcy

Group Percentage of speriod in cell cycle Control 23.36±1.89 Hcy 29.40±2.07*18α-GA 14.33 ±1.13*#Hcy+18α-GA 21.18 ±1.37#

2.2.3 Western blot法檢測SHR VSMCs內(nèi)Cx40、Cx43蛋白表達(dá) 與control組相比,Hcy組Cx43、Cx40蛋白表達(dá)均增強(qiáng)(P＜0.05),18α-GA 組Cx43、Cx40表達(dá)均減弱(P＜0.05),Hcy+18α-GA 組Cx43、Cx40表達(dá)均無顯著性差異(P＞0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA 組 Cx43、Cx43 表達(dá)減弱(P＜0.05,圖3,表 3)。

2.2.4 染料示蹤分子傳遞法檢測血管平滑肌細(xì)胞間縫隙連接功能 與control組相比較,Hcy組熒光染料傳遞分?jǐn)?shù)增加,縫隙連接功能明顯增強(qiáng)(P＜0.05),18α-GA組熒光染料傳遞分?jǐn)?shù)降低,縫隙連接功能明顯減弱(P＜0.05),Hcy+18α-GA組熒光染料傳遞分?jǐn)?shù)無明顯差異,縫隙連接功能無顯著差異(P＞0.05);與Hcy組相比,Hcy+18α-GA 組熒光染料傳遞分?jǐn)?shù)降低,縫隙連接功能顯著降低(P＜0.05,圖 4,表 4)。

Fig.3 Expression of the Cx43 and Cx40 proteins in SHR VSMCs of different groups

Tab.3 Expression of the Cx43 and Cx40 proteins in VSMC of different groups(±s,n=3)

Tab.3 Expression of the Cx43 and Cx40 proteins in VSMC of different groups(±s,n=3)

Hcy:Homocysteine;GA:Glycyrrhetinic acid;VSMC:Vascular smooth muscle cell;Cx:Connexin*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Hcy

Group Cx43/β-actin Cx40/β-actin Control 0.31±0.02 0.36±0.01 Hcy 0.62±0.14* 0.42±0.02*18α-GA 0.28±0.01*# 0.31±0.01*#Hcy+18α-GA0.32±0.01# 0.35±0.02#

Fig.4 Atlas of gap junctionfunction detected by scrape dye transfer method of scrape dye transfer method in VSMC of different groups(scale bar=100μ m)

3 討論

近年來的研究表明高同型半胱氨酸血癥能夠?qū)е卵軆?nèi)皮損害,促進(jìn)低密度脂蛋白的氧化、血小板的聚集、血管平滑肌細(xì)胞增殖,對正常大鼠VSMCs的作用由于細(xì)胞密度,Hcy濃度的不同而不同。研究發(fā)現(xiàn)一定劑量的Hcy能誘導(dǎo)SHR VSMCs增殖[5,6],在我們前期的研究中顯示:隨著Hcy濃度的升高,SHR VSMCs增殖增加明顯,當(dāng)Hcy濃度 ＞0.1 mmol/L時,細(xì)胞增殖增加開始降低。

Tab.4 Percentage of immune fluorescent dye transfered in SHR VSMCs of different groups(±s,n=3)

Tab.4 Percentage of immune fluorescent dye transfered in SHR VSMCs of different groups(±s,n=3)

Hcy:Homocysteine;GA:Glycyrrhetinic acid;SHR:Spontaneously hypertension rat;VSMC:Vascular smooth muscle cell*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs Hcy

Group Percentage of immune fluorescent dye transfered Control 0.61±0.10 Hcy 0.74±0.17*18α-GA 0.46 ±0.05*#Hcy+18α-GA 0.60 ±0.12#

縫隙連接是由連接相鄰兩個細(xì)胞之間的連接通道排列而成的一種特殊膜結(jié)構(gòu)。它由細(xì)胞膜上的連接子相互銜接而成,每個連接子由六個縫隙連接蛋白(Cx)圍成,連接子即Cx的六聚體所形成的跨膜蛋白通道[7]。不同類型的連接蛋白可以形成不同類型的連接子,構(gòu)成不同類型的連接通道,不同連接蛋白分子之間組合形成的縫隙連接通道的通透性和導(dǎo)電性有所不同[8],從而使得縫隙連接在結(jié)構(gòu)組成和功能上表現(xiàn)出多樣性[9],并對血管平滑肌舒縮等生理過程起著重要的調(diào)控作用。而血管平滑肌細(xì)胞以Cx43,Cx40表達(dá)為主。

我們通過用Hcy和縫隙連接阻斷劑(18α-GA)處理SHR VSMCs,通過MTT法和流式細(xì)胞技術(shù)檢測SHR VSMCs A值和S值發(fā)現(xiàn):Hcy進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞的增殖,當(dāng)縫隙連接阻斷后,完全阻斷了Hcy對細(xì)胞的促增殖效應(yīng)。本研究結(jié)果首次證實,縫隙連接可能參與了Hcy介導(dǎo)的SHRVSMCs的增殖作用。

為了進(jìn)一步探討Hcy是否通過改變連接蛋白的表達(dá),調(diào)節(jié)縫隙連接通道的功能,影響細(xì)胞間直接通訊,并導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞增殖?在本研究中我們用激光共聚焦顯微鏡觀察Cx43、Cx40蛋白表達(dá)及定位,結(jié)果顯示兩者共定位于胞漿,并通過Western blot各組Cx43、Cx40的蛋白表達(dá),結(jié)合劃痕標(biāo)記染料傳輸法檢測了不同處理因素作用下各組縫隙連接功能的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn):Hcy可使SHR VSMCs Cx43和Cx40蛋白表達(dá)上調(diào),增強(qiáng)了縫隙連接通訊功能?？p隙連接阻斷劑抑制了Hcy引發(fā)的Cx43和Cx40蛋白表達(dá)上調(diào),并降低了縫隙連接功能。

在以往的研究中已證實Hcy都能通過細(xì)胞間間接通訊的方式引起高血壓,動脈粥樣硬化等心血管疾病的發(fā)生和發(fā)展。本研究以SHR血管平滑肌細(xì)胞為模型,發(fā)現(xiàn)Hcy通過上調(diào)SHR血管平滑肌細(xì)胞縫隙連接蛋白Cx43和/或Cx40的表達(dá),引起細(xì)胞間直接通訊-縫隙連接通訊功能的增強(qiáng),促進(jìn)了SHR血管平滑肌細(xì)胞的增殖作用。進(jìn)一步闡明了Hcy在高血壓等血管平滑肌細(xì)胞增殖相關(guān)疾病中的作用機(jī)制,并提供了新的理論基礎(chǔ)。

此外,縫隙連接功能的調(diào)節(jié)受多種因素的影響,如縫隙連接蛋白的表達(dá),縫隙連接蛋白的磷酸化等,在本研究中我們僅從縫隙連接蛋白的表達(dá)做了初步研究,那么在不同處理因素作用下,縫隙連接蛋白的磷酸化有何變化?另外在本研究發(fā)現(xiàn)縫隙連接蛋白Cx43、Cx40參與了Hcy介導(dǎo)SHR血管平滑肌細(xì)胞增殖作用,在今后的研究中,我們將通過干擾Cx43、Cx40基因,進(jìn)一步探討縫隙連接在Hcy介導(dǎo)SHR血管平滑肌細(xì)胞增殖作用及機(jī)制,為心腦血管疾病防治提供新靶標(biāo)。

[1]Azzam E I,de Toledo S M,Little J B.Evidence for the participation of gap junction-mediated intercellular communication in the transmission of damage singals from alpha-particle irradiated to nonirradiated cells[J].ProcNatlAcad Sci USA,2001,98(2):473-478.

[2]張會敏,張海洋,鄧峰美,等.同型半胱氨酸對鈣離子激活狀態(tài)下內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性及NO含量的影響[J].石河子大學(xué)學(xué)報,2007,25(2):196-199.

[3]Rodrigo R,Passalacqua W,Araya J,et al.Homocysteine and essential hypertension[J].J Clin Pharmacol,2003,43(12):1299-1306.

[4]鐘 華,何 芳,胡清華,等.ERK和Smad通路在TGF-β1抑制大鼠血管平滑肌細(xì)胞增殖中的作用[J].中國病理生理雜志,2009,25(9):1665-1670.

[5]Lee H Y,Chae I H,Kim H S,et al.Differential effects of homocysteine on porcine endothelial and vascular smooth muscle cells[J].J Cardiovasc Pharmacol,2002,39(5):643-651.

[6]Woo D K,Dudrick S J,Sumpio B E,et al.Homocysteine stimulatesMAP kinase in bovine aortic smooth muscle cells[J].Surgery,2000,128(1):59-66.

[7] S?hl G,Willecke K.Gap junctions and the connexin protein family[J].Cardiovasc Res,2004,62(2):228-232.

[8]Huang X D,Sandushy G E,Zipes D P,et al.Heterogeneous loss of Cx43 protein in ischemic dog heats[J].J Cardiovasc Eletrophysiol,1999,10(1):79-91.

[9]Figueroa X F,Duling B R.Gap junctions in the control of vascular function[J].Antioxid Redox Signal,2009,11(2):251-266.