張 怡,黃國良

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌研究所,福州 350001)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病常見和嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一,近年來炎癥因子及炎癥反應(yīng)成為了DN的新視點(diǎn)。腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)是糖尿病腎病時(shí)的主要相關(guān)炎癥因子,已有研究證實(shí)糖尿病腎病時(shí)血清中TNF-α表達(dá)明顯升高,且與C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)水平及DN的程度一致[1]。TNF-α通過與受體的結(jié)合,激活許多信號傳導(dǎo)通路,導(dǎo)致多種轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),有證據(jù)證明TNF-α參與DN病理生理機(jī)制,調(diào)控糖尿病腎損傷不同效應(yīng)。我們可通過阻斷其產(chǎn)生的通路來預(yù)防DN的發(fā)生,但目前對于其產(chǎn)生的機(jī)制尚未有研究報(bào)道。本研究在體外模擬糖尿病高血糖環(huán)境,就高糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)TNF-α的機(jī)制方面進(jìn)行初步的研究和探討。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

人腎小球系膜細(xì)胞株為福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院內(nèi)分泌研究所保藏,常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。p38MAPK特異性抑制劑SB203580購自sigma公司,NF-κ B特異性抑制劑 PDTC購自碧云天生物技術(shù)研究所,總RNA提取試劑Trizol購自加拿大Bio Basic Inc公司,RIPA裂解液、細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒均購自碧云天生物技術(shù)研究所,RT-PCR試劑盒購自Fermentas公司,磷酸化p38MAPK蛋白一抗購自Cell signaling technology,NF-κ Bp65蛋白一抗購自碧云天生物技術(shù)研究所,PCR擴(kuò)增儀為美國ABI公司產(chǎn)品,凝膠成像分析系統(tǒng)為Tanon Gis產(chǎn)品,垂直電泳系統(tǒng)和電轉(zhuǎn)系統(tǒng)為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 腎小球系膜細(xì)胞培養(yǎng)及處理

腎小球系膜細(xì)胞以105cells/well密度接種于6孔培養(yǎng)板中,用含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),37℃、5%CO2溫箱孵育至亞融合狀態(tài)后更換為無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h使之同步化,然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組要求換用加入各種處理因素的1%胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組為低糖對照組(5.6 mmol/L);高糖組(20 mmol/L);高糖(20 mmol/L)+SB203580(10 μ mol/L)組 ;高 糖(20 mmol/L)+PDTC(10 μ mol/L)組 。SB203580或PDTC預(yù)處理系膜細(xì)胞30 min后,再加入高糖溶劑使培養(yǎng)液葡萄糖終濃度達(dá)到20 mmol/L。作用48 h后分別測定系膜細(xì)胞TNF-αmRNA、磷酸化p38MAPK蛋白、NF-κ B p65蛋白表達(dá)。

1.3 RT-PCR方法檢測系膜細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)

細(xì)胞用PBS迅速?zèng)_洗2次,提取細(xì)胞總RNA,用紫外分光光度計(jì)測定其濃度和純度,計(jì)算樣品總RNA濃度。取總RNA 2 μ g,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。TNF-α引物(上游 5'-CAGAGGGAAGAGTTCCCCAG-3',下游5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3')是根據(jù)Li等的序列設(shè)計(jì)[2],由 Invitrogen公司合成的,可擴(kuò)增出長度為325 bp的TNF-αcDNA片段;β-actin引物(上游5'-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3',下游5'-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3')為福建醫(yī)科大學(xué)協(xié)和臨床醫(yī)學(xué)院血液研究所饋贈(zèng),可擴(kuò)增出長度為500 bp的β-actin cDNA片段。PCR反應(yīng)條件:TNF-α:94℃變性40 s,64℃退火40 s,72℃延伸40 s;β-actin:94℃變性30 s,58℃退火30s,72℃延伸30 s,共進(jìn)行35個(gè)循環(huán),首次循環(huán)前先在94℃預(yù)變性5 min,最后一輪循環(huán)后在72℃終末延伸7 min。PCR產(chǎn)物于含1%Goldview核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠電泳,以DNA Marker(600 bp)作為標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)記,電泳后于紫外透射儀觀察并拍照,應(yīng)用凝膠圖像分析系統(tǒng)軟件對目的電泳條帶進(jìn)行分析,以相應(yīng)的內(nèi)參電泳條帶作為參照,結(jié)果以兩者之積分吸光度的比值表示。每組樣本數(shù)是3例。

1.4 Western blot法檢測系膜細(xì)胞磷酸化p38MAPK蛋白及NF-κ B p65蛋白表達(dá)

細(xì)胞用PBS迅速?zèng)_洗2次,加入RIPA裂解液在冰上孵育30 min,4℃、14 000 r/min離心 15 min提取總蛋白;按照試劑盒說明書操作提取細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白。按照BCA試劑盒說明書操作測定各組蛋白濃度,以Western blot法分別檢測細(xì)胞內(nèi)磷酸化p38MAPK蛋白水平、細(xì)胞核與細(xì)胞漿NF-κ B p65蛋白水平。經(jīng)圖像分析系統(tǒng)對目的條帶及內(nèi)參條帶進(jìn)行掃描和灰度分析,結(jié)果以兩者灰度比值表示。每組樣本數(shù)是3例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SB203580、PDTC對高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞 TNF-αmRNA表達(dá)的影響

與低糖對照組相比,高糖組系膜細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)明顯增加(P＜0.01)。而與高糖組相比,SB203580組、PDTC組系膜細(xì)胞TNF-αmRNA表達(dá)均明顯降低(P＜0.01)。表明高糖可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞內(nèi)TNF-α在基因水平的表達(dá),抑制系膜細(xì)胞p38MAPK、NF-κ B活性可明顯抑制高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞內(nèi)TNF-α的表達(dá)(表1)。

Tab.1 Changes of TNF-αmRNA expression in glomerular mesangial cells(±s,n=3)

Tab.1 Changes of TNF-αmRNA expression in glomerular mesangial cells(±s,n=3)

HG:High glucose group;SB203580:p38MAPK specific inhibitor;PDTC:NF-κ B specific inhibitor;TNF-α:Tumor necrosis factor-α**P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs HG group

Control 0.3772±0.0332 HG 0.8890±0.0228**SB203580 0.4963±0.0284##PDTC 0.4734±0.0292##

2.2 SB203580對高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞磷酸化p38MAPK表達(dá)的影響

與低糖對照組相比,高糖組系膜細(xì)胞磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)增加(P＜0.01)。與高糖組相比,SB203580組系膜細(xì)胞磷酸化p38MAPK蛋白表達(dá)減少(P＜0.01,圖1)。表明高糖可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞內(nèi)p38MAPK蛋白活化,SB203580明顯抑制了高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞內(nèi)p38MAPK蛋白的活化(圖2)。

Fig.1 Expression of phosphorylation p38MAPK in glomerular mesangial cells stimulated by SB203580 and high glucose

2.3 SB203580對高糖培養(yǎng)系膜細(xì)胞NF-κ B p65蛋白表達(dá)的影響

與低糖對照組相比,高糖組系膜細(xì)胞NF-κ B p65蛋白在胞核內(nèi)表達(dá)增加(P＜0.01),胞漿內(nèi)表達(dá)減少(P＜0.01)。而與高糖組相比,SB203580組系膜細(xì)胞NF-κ B p65蛋白在胞核內(nèi)表達(dá)減少(P＜0.01),胞漿內(nèi)表達(dá)增加(P＜0.01,圖3)。表明高糖可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞內(nèi)NF-κ B蛋白轉(zhuǎn)核活化,SB203580可明顯抑制高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞內(nèi)NF-κ B蛋白的活化(圖4)。

3 討論

Fig.2 Effect of SB203580 on phosphorylation p38MAPK expression in glomerular mesangial cells(±s,n=3)

Fig.3 Expression of NF-κ B p65 in glomerular mesangial cells stimulated by SB203580 and high glucose

Fig.4 Effect of SB203580 on NF-κ B p65 expression inglomerular mesangial cells(±s,n=3)

近年來的研究表明慢性低度炎癥可能誘導(dǎo)了2型糖尿病患者的腎臟病變,而前炎癥因子是導(dǎo)致慢性低度炎癥的始發(fā)及促進(jìn)因素之一,TNF-α是目前研究較為廣泛的前炎癥因子。TNF-α參與多種生理和免疫過程,具有抗腫瘤、促進(jìn)細(xì)胞生長、誘導(dǎo)細(xì)胞分化凋亡、影響糖脂代謝、誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子產(chǎn)生等生物功能。Navarro等研究發(fā)現(xiàn),DN患者與糖尿病無腎病改變患者相比血漿及尿液中TNF-α的表達(dá)明顯升高,且與DN病理分期成正相關(guān)[3]。與此研究一致,本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,高糖培養(yǎng)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)TNF-αmRNA表達(dá)升高。Bai等的研究發(fā)現(xiàn),p38MAPK抑制劑及NF-κ B抑制劑均可抑制高半胱氨酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TNF-α[4]。故我們猜測,p38MAPK抑制劑及NF-κ B抑制劑亦可抑制高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞表達(dá)TNF-α。

p38MAPK是MAPK家族的一員,是調(diào)節(jié)許多細(xì)胞功能的一個(gè)重要激活信號分子,磷酸化 p38MAPK為其活性形式。本研究發(fā)現(xiàn),高糖可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)p38MAPK活化,而p38MAPK特異性抑制劑SB203580可明顯抑制TNF-αmRNA表達(dá),表明p38MAPK參與介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)。

NF-κ B是由Rel蛋白家族的成員以同源或異源二聚體的形式組成的一組轉(zhuǎn)錄因子,參與細(xì)胞內(nèi)的信號傳遞,調(diào)控多種基因的表達(dá)。Navarro等研究發(fā)現(xiàn),鏈脲霉素誘導(dǎo)糖尿病腎病大鼠的腎臟組織中NF-κ B亞單位p50及p65明顯升高,與血糖、尿白蛋白排泄率(urinary albumin excretion rates,UAER)及血肌酐升高呈明顯正相關(guān)[5]。我們的研究也發(fā)現(xiàn),高糖可誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)NF-κ B蛋白轉(zhuǎn)核活化,NF-κ B特異性抑制劑PDTC可明顯抑制TNF-αmRNA表達(dá)。同時(shí)本研究顯示,SB203580可明顯抑制高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞內(nèi)NF-κ B蛋白轉(zhuǎn)核活化,表明p38MAPK與NF-κ B存在相互作用,二者共同參與介導(dǎo)高糖誘導(dǎo)系膜細(xì)胞內(nèi)TNF-α表達(dá),且存在交叉作用。

本研究初步闡明了高糖誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞表達(dá)TNF-α的相關(guān)機(jī)制,為糖尿病腎病的治療提供全新的理論基礎(chǔ),同時(shí)也為臨床提供新的更為有效的診治手段。

[1]馬直勉,李海永.血清C-反應(yīng)蛋白、TNF-α、IL-6與 2型糖尿病腎病的關(guān)系[J].國際免疫學(xué)雜志,2007,30(6):367-369.

[2]Li H,Li X W,Duan L,et al.Inhibition of lovastatin on proliferation and expression of proinflammatory cytokines in cultured human glomerular mesangial cells[J].Chinese Medical Journal,2003,116(9):1366-1369.

[3]Navarro J F,Mora C,GomezM,et al.Influence of renalinvolvement on peripheral blood mononuclear cell expression behaviour of tumour necrosis factor-α and interleukin-6 in type 2 diabetic patients[J].NephrolDialTransplant,2008,23(3):919-926.

[4]Bai Y P,Liu Y H,Chen J,et al.Rosiglitazone attenuates NF-kappaB-dependent ICAM-1 and TNF-alpha production caused by homocysteineviainhibiting ERK1/2/p38MAPK activation[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,360(1):20-26.

[5]Navarro J F,Mora C.Diabetes,inflammation,proinflammatory cytokines,and diabetic nephropathy[J].Scientific World J,2006,6:908-917.