王利利,納 鑫,朱小南,陳汝筑,汪 海,汪雪蘭△

(1.中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室,廣州 510080;2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所,天津 300050)

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,其典型的病理改變?yōu)樯窠?jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangle,NFT)和老年斑(senile plaque,SP),分別由Tau蛋白異常磷酸化和淀粉樣蛋白(β-amyloid protein,Aβ)沉積引起。Tau和Aβ在AD發(fā)病機制中的作用和相互關(guān)系,以及產(chǎn)生的前后順序等尚未有定論[1]。

AD動物模型是研究AD發(fā)病機制和研發(fā)治療藥物的必要工具。與AD相關(guān)的Tau、淀粉樣前體蛋白(amyloid precusor protein,APP)、早老素(presenilins,PS)等基因的單轉(zhuǎn)基因模型通常只能模擬AD其中一種病理變化。鑒于AD發(fā)病為多因素共同致病,所以利用不同的轉(zhuǎn)基因鼠雜交或多個基因同時轉(zhuǎn)入等方法,得到的多重(雙轉(zhuǎn)或三轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)基因模型能更好的模擬臨床AD的發(fā)病過程和病理特征[2]。

本課題是將自行建立的Tau轉(zhuǎn)基因小鼠[3]與美國Jackson實驗室引種的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠[4]雜交,篩選獲得Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠,旨在建立具有Tau和Aβ兩種病理改變和學(xué)習記憶障礙的動物模型,為深入探究Tau與Aβ的關(guān)系、闡明AD的發(fā)病機制以及研發(fā)靶點治療藥物提供實驗工具。

1 材料與方法

1.1 動物

Tau轉(zhuǎn)基因小鼠由本實驗室自行建立的,APP/PS1二轉(zhuǎn)基因小鼠購自南京大學(xué)模式動物研究所,是從 美國Jackson實驗室引種,品系名稱 B6C3-Tg[APPswe,PSEN1dE9]m 85Dbo/J。

1.2 藥品與試劑

抗人Tau蛋白的單克隆抗體(Tau-13)購自Santa Cruz公司;抗人Aβ蛋白的單克隆抗體購自CST公司;PVDF膜、二抗及ECL發(fā)光試劑盒均購自Amersham公司;ABC染色劑和DAB顯色劑購自Vector公司。

1.3 基因型鑒定

1.3.1 基因組DNA的提取 取鼠尾0.5～1 cm放入0.5 ml裂解緩沖液中(1%SDS、75 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-Cl、25 mmol/L EDTA),加 20 g/L 蛋白酶K 2.5 μ l,置55℃振動恒溫搖床200 r/min消化過夜。酚/氯仿法提取和純化基因組DNA。

1.3.2 PCR Tau引物序列為5'-GGAGTTCGAAGTGATGGAAG-3'和5'-GGTTTTTGCTGGAATCCTGG-3',APP和PS1引物是根據(jù)Jackson實驗室網(wǎng)站公布的序列。PCR反應(yīng)為 94℃5 min;94℃45 s、56℃45 s和72℃45 s,共35個循環(huán),72℃10min,2%瓊脂糖凝膠電泳后,用GENE GENIUS凝膠成像系統(tǒng)分析。

1.4 Morris水迷宮觀測學(xué)習記憶的改變

1.4.1 定位航行實驗 實驗5 d,每天訓(xùn)練4次,每次間隔15 min。訓(xùn)練時隨機選擇一個象限為入水點,采用遠離目標的象限入水成績作為評價指標[4],實驗時間90 s,將小鼠找到水下平臺的時間計為逃逸潛伏期。

1.4.2 空間搜索試驗 在最后一次訓(xùn)練后撤除水下平臺,然后在平臺所在象限的對面象限的中點為入水點將小鼠面向池壁放入水中,測定它在90 s內(nèi)跨過水下平臺位置的次數(shù)。記錄上述參數(shù)和游泳路線軌跡。

1.5 RT-PCR檢測Tau、APP、PS1基因的轉(zhuǎn)錄

1.5.1 總RNA的提取、鑒定和含量測定 取大腦提取RNA,瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的完整性,紫外分光光度計測定總RNA含量。

1.5.2 RT-PCR 反應(yīng)體系包括 RNA 1 μ g,5×RT buffer 4.0 μ l,Olig(dT)20(20 μ mol/L)1.0 μ l,dNTP(10 mmol/L)2.0 μ l,RTase 1.0 μ l,DEPC water 至總體積為20 μ l。42℃孵育 60 min,95 ℃5 min,冰浴 5 min,PCR方法同前。

1.6 Western blot測定Tau和APP蛋白的表達量

1.6.1 蛋白的提取 取小鼠大腦,分離皮層和海馬區(qū)50～100 mg于離心管中,加裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCL 10 ml,10%SDS 100 μ l,NP-40 100 μ l,2%NaN3 100 μ l,100 mmol/L PMSF 100 μ l,200 mmol/L NaVO450 μ l,EGTA 38.036 mg,蛋白酶抑制劑半片),12 000 r/min超聲破碎30 min,取上清,100℃煮沸5 min備用。

1.6.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳 配制8%的分離膠和4%的積層膠,取樣本35 μ g上樣于加樣孔中,200 V恒壓下電泳45 min。100 V轉(zhuǎn)膜60 min,孵育目的抗體,曝光,拍照,計算機圖像分析。

1.7 Bielschowsky染色法觀察神經(jīng)纖維纏結(jié)

將腦組織切片浸在4%硝酸銀中30 min;10%甲醛數(shù)秒,滴加氨銀乙醇溶液20～40 s,10%甲醛1～2 min,5%硫代硫酸鈉固定;梯度酒精脫水,中性樹膠封片。

1.8 ABC免疫組化法觀察老年斑

按試劑盒步驟操作。

2 結(jié)果

2.1 基因型鑒定

內(nèi)參β-actin1是 700 bp,β-actin2是 300 bp;Tau 是500 bp,APP是350 bp,PS1是608 bp。PCR結(jié)果顯示,1號是Tau小鼠,2號和3號為Tau/APP/PS1小鼠(圖1)。

Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR products

2.2 大腦Tau、APP、PS1基因的轉(zhuǎn)錄

Tau為500 bp,APP為350 bp,PS1為608 bp。RTPCR結(jié)果顯示,1號是Wt小鼠,2號是Tau小鼠;3號是APP/PS1小鼠;4號是Tau/APP/PS1小鼠(圖2)。

Fig.2 Detection gene transcription in the brains of mice

2.3 海馬和皮層的Tau和Aβ蛋白表達量

取8月齡小鼠,Western blot結(jié)果顯示:4是Tau/APP/PS1小鼠的海馬及皮層,均有Tau和Aβ蛋白;3是APP/PS1小鼠的海馬及皮層,只有Aβ蛋白,2是Tau小鼠的海馬及皮層,只有Tau蛋白(圖3)。Tau蛋白量在Tau/APP/PS1和Tau小鼠的海馬和皮層無差異;Aβ蛋白量在Tau/APP/PS1小鼠的海馬高于APP/PS1小鼠29.6%,在皮層無差異(表1)。Tau/APP/PS1小鼠海馬Tau蛋白量高于皮層22.1%,皮層Aβ蛋白量高于海馬48.6%(表2)。

Fig.3 Expression of Tau and Aβ protein in 8-month transgenic mice(n=5)

Tab.1 Comparison of Tau and A β protein content in 8-month transgenic mice(±s,n=5)

Tab.1 Comparison of Tau and A β protein content in 8-month transgenic mice(±s,n=5)

*P＜0.05 vs APP/PS1

Protein type Mouse type Hippocampus Cortex Tau Tau 1.000±0.031 1.000±0.027 Tau/APP/PS1 1.053±0.125 1.029±0.314 Aβ APP/PS1 1.000±0.028 1.000±0.041 Tau/APP/PS1 1.296±0.264*0.865±0.276

Tab.2 Comparison of Tau and A β protein content in Tau/APP/PS1 transgenic mice(±s,n=5)

Tab.2 Comparison of Tau and A β protein content in Tau/APP/PS1 transgenic mice(±s,n=5)

*P＜0.05 vs Tau/APP/PS1

Protein type Hippocampus Cortex Tau 1.221±0.236 1.000±0.147*Aβ 0.673±0.235 1.000±0.179*

Fig.8 Escape latency in Tau/APP/PS1 triple transgenic mice of different months(±s,n=10)

2.4 海馬和皮層的神經(jīng)纖維纏結(jié)

取3、6和8月齡小鼠,F是8月齡Tau/APP/PS1小鼠的海馬和皮層 Bielschowsky染色可見火焰狀或球形的神經(jīng)纖維纏結(jié);E是8月齡的APP/PS1小鼠的海馬和皮層,未見此改變。箭頭所示為神經(jīng)纖維纏結(jié)(圖 4,5見彩圖頁Ⅰ)。

2.5 海馬和皮層的老年斑

取3、6和8月齡小鼠,C是 6月齡APP/PS1小鼠的海馬和皮層,ABC免疫組化可見少量老年斑;右D是6月齡Tau/APP/PS1小鼠皮層可見老年斑,而海馬沒有;E和F分別是8月齡的APP/PS1、Tau/APP/PS1小鼠的海馬和皮層,均可見老年斑。箭頭所示為老年斑(圖6,7見彩圖頁Ⅰ)

2.6 學(xué)習記憶的改變

取3、6和9月齡小鼠,Morris水迷宮實驗顯示:6月齡Tau/APP/PS1小鼠逃逸潛伏期在第1、2、3天時分別為73.49±15.94(s)、59.16±14.96(s)、47.92±15.76(s),9月齡時在第2、3、4、5天時逃逸潛伏期分別為78.45±21.33、68.43±14.58、54.35±14.58、58.43±13.26,與Wt小鼠相比延長(圖 8,P＜0.05)。

6月齡Tau/APP/PS1小鼠穿越平臺次數(shù)為2.00±0.54,9月齡Tau/APP/PS1小鼠穿越平臺次數(shù)為2.40±0.72,與Wt小鼠相比穿越平臺次數(shù)減少(圖9)。

3 討論

AD的轉(zhuǎn)基因動物模型包括單轉(zhuǎn)和多重(雙轉(zhuǎn)或三轉(zhuǎn))轉(zhuǎn)基因模型,多重轉(zhuǎn)基因模型比單轉(zhuǎn)模型的模擬AD病理變化和行為學(xué)改變特征的程度更高,逐漸成為研究AD的主流動物模型。多重轉(zhuǎn)基因小鼠的建立方法有多種,主要通過雜交繁育、顯微共注射或同時運用兩種方法。AD最常見的雙轉(zhuǎn)基因模型是APP/PS1小鼠,大多是轉(zhuǎn)入APPswe基因,但轉(zhuǎn)入PS基因片段會有多種選擇,此類模型通常在6月齡發(fā)現(xiàn)Aβ蛋白沉積,9月齡出現(xiàn)學(xué)習記憶障礙[5]。APP/Tau雙轉(zhuǎn)基因小鼠是首個能同時出現(xiàn)NFT和SP,模擬AD病理特征較為全面的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。由Tg2576小鼠和tau P301L(JNPL3)小鼠雜交而來,名為TAPP鼠[6],但常表現(xiàn)為體重減輕、后肢萎縮、彎腰駝背、發(fā)音和睜眼困難,其行為學(xué)改變因其身體狀況差而較難確定。APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠是先由單轉(zhuǎn)PS1M146V小鼠自交得到純合子,再分別將突變基因APPSwe和tauP301L顯微注射入純合子的胚胎干細胞,篩選而得[7];在6月齡出現(xiàn)認知障礙和Aβ沉積;Aβ沉積出現(xiàn)在NFT之前,首先沉積在皮質(zhì),然后在海馬。12月齡出現(xiàn)NFT,是先海馬后皮質(zhì)。

Fig.9 Platform probe frequency in transgenic mice of different months(±s,n=10)

Jankowsky等[4]將由小鼠的朊蛋白啟動子(Prp)啟動的突變APP和PS1基因顯微共注射到小鼠受精卵中,構(gòu)建了APP/SP1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型,APP和PS1基因是整合在染色體的同一或相臨位置,即APP和PS1是連鎖的。6月齡APP/SP1小鼠腦內(nèi)可見老年斑,并有行為學(xué)改變。本實驗室將帶有小鼠特異性的神經(jīng)元啟動子Thy-1和含有P301L突變的人最長Tau蛋白的異構(gòu)體,用雄原核顯微注射法,建立了Tau轉(zhuǎn)基因小鼠模型[3],能穩(wěn)定傳代,9月齡可見神經(jīng)元纖維纏結(jié)和有空間記憶力損害,12月齡有神經(jīng)元丟失。

本課題是將以上的Tau轉(zhuǎn)基因小鼠與APP/SP1轉(zhuǎn)基因小鼠雜交,建立Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠模型。實驗結(jié)果顯示,Tau/APP/PS1小鼠大腦可轉(zhuǎn)錄和表達Tau、APP和PS1三種外源基因;8月齡Tau/APP/PS1小鼠海馬Aβ蛋白高于APP/PS1小鼠29.6%,海馬Tau蛋白高于皮層22.1%,皮層Aβ蛋白比海馬高48.6%;8月齡海馬與皮層可觀察到大量的NFTs;6月齡皮層可見老年斑,比相同月齡的APP/PS1小鼠多;6月齡開始記憶保持能力受損。提示,Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠中Tau基因的表達能促進Aβ含量的增加;NFT先出現(xiàn)在海馬,SP則在皮層出現(xiàn)較早;Aβ沉積首先在皮層,而后到海馬。

本研究建立的Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠模型與Wengenack等人[5]建立的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠相比,增加了Tau病變;與Lewis等人[6]建立的APP/Tau雙轉(zhuǎn)基因小鼠相比,沒有大腦外的身體改變;與Oddo等人[7]建立的APP/PS1/Tau三轉(zhuǎn)基因小鼠有相似之處。此模型尚需傳代建系和深入研究其他生物學(xué)特征,并需要用染色體熒光原位雜交確定外源基因的插入位點。

AD的動物轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因模型有多種,每一種模型都在一定的程度上或某些方面模擬AD的病理改變或癥狀,每種建立轉(zhuǎn)基因模型的方法各自具有相應(yīng)的適用范圍和作用,又各有優(yōu)勢與不足,但仍然沒有一種模型可以完全模擬完整的AD特征[8]。

目前國內(nèi)AD研究所用的Tau/APP/PS1三重轉(zhuǎn)基因小鼠全部依賴國外進口,存在成本昂貴和外源基因易丟失等問題。本研究所建立的Tau/APP/PS1三轉(zhuǎn)基因小鼠模型具有Tau和Aβ兩種病理改變和學(xué)習記憶障礙,為深入探究Tau與Aβ的關(guān)系、闡明AD的發(fā)病機制以及研發(fā)靶點治療藥物提供實驗工具。

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