呂建林，徐彥

(1.南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 211100;2.江蘇省中醫(yī)院泌尿外科，江蘇 南京 210029)

感染性結(jié)石形成的先決條件是解脲酶微生物引起的持續(xù)性尿路感染，必要條件是解脲酶微生物產(chǎn)生的脲酶對(duì)尿中尿素的分解［1-2］。與感染性結(jié)石最相關(guān)的致病性解脲酶微生物是奇異變形桿菌。奇異變形桿菌及其產(chǎn)生的脲酶對(duì)尿路上皮細(xì)胞損傷后所導(dǎo)致的一系列病理生理改變以及細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)在感染性結(jié)石的形成中起著重要的作用。尿路的病理性損害又成為引發(fā)感染性結(jié)石形成的因素，并進(jìn)一步加重尿路感染。本研究目的在于觀察實(shí)驗(yàn)性大鼠尿路感染性結(jié)石形成所導(dǎo)致的尿路組織病理學(xué)的改變，以及尿路組織病理學(xué)改變對(duì)感染性結(jié)石成因的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

雄性SD純種大鼠，體重(180±10)g，由南京青龍山動(dòng)物飼養(yǎng)廠提供(許可證號(hào):SCXK-2009-0007)。大鼠均在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心清潔級(jí)飼養(yǎng)室中飼養(yǎng)，可以自由獲取食物及飲水，室溫(20±2)℃，濕度50% ～60%。

奇異變形桿菌由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬軍區(qū)總醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物室提供。

HM 325無(wú)水乙醇、甲醛、二甲苯、多聚賴氨酸(南京化學(xué)試劑有限公司)，PBS緩沖液和枸櫞酸緩沖液(南京生興生物技術(shù)有限公司);蘇木素、伊紅(美國(guó)Sigma公司)，抗兔二抗試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，兔抗THP(Tamm-Horsfall蛋白)抗體(美國(guó)Santa Cruz公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌液及異物制備 在血瓊脂平板上孵育奇異變形桿菌24 h后，從血瓊脂平板上挑出單個(gè)菌落，用5 ml鹽水制成懸液。在充足光線下，背對(duì)著有白色背景與黑色對(duì)比線條的卡片，將接種管與0.5號(hào)麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行目測(cè)比較，將菌懸液調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠞岫?。此時(shí)菌懸液內(nèi)培養(yǎng)物大約含1～2×108CFU·ml－1。再將菌懸液用鹽水1∶10稀釋，獲得107CFU·ml－1的菌液。另取聚乙烯管(長(zhǎng)4 mm，直徑為0.5 mm)，浸泡于107CFU ml－1的細(xì)菌菌懸液中，置于恒溫箱中共同培養(yǎng)8 h以上。

1.2.2 模型分組 為排除非健康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后分組造模。SD雄性大鼠24只，分為3組?？瞻讓?duì)照組(n=4):每天普通飼料喂養(yǎng)(10 g·只－1)，膀胱內(nèi)不置入任何異物。假手術(shù)組(n=10):以 25%烏爾坦(1.0 g·kg－1)腹腔注射麻醉，腹部皮膚去毛后以1.5%碘伏消毒，鋪無(wú)菌手術(shù)巾。麻醉滿意后取恥骨弓上方下腹部正中切口，切開腹腔，提起膀胱，使用無(wú)菌G18穿刺針，于膀胱頂部穿刺入膀胱后直接退出，膀胱內(nèi)不置異物，關(guān)閉腹腔，術(shù)后6 h后恢復(fù)進(jìn)食、進(jìn)水。實(shí)驗(yàn)組(n=10):以25%烏爾坦(1.0 g·kg－1)腹腔注射麻醉，腹部皮膚去毛后以1.5%碘伏消毒，鋪無(wú)菌手術(shù)巾。麻醉滿意后取恥骨弓上方下腹部正中切口，切開腹腔，提起膀胱，以無(wú)菌G18穿刺針于膀胱頂部穿刺入膀胱，經(jīng)穿刺針內(nèi)腔，使用推桿將聚乙烯管［此前浸泡于107CFU·ml－1的細(xì)菌菌懸液中，置于恒溫箱(37℃)中共同培養(yǎng)8 h以上］推入膀胱，退出穿刺針后關(guān)閉腹腔，術(shù)后6 h后恢復(fù)進(jìn)食、進(jìn)水。以上各組動(dòng)物白天均投以充足的普通飼料，自由飲水。

1.2.3 標(biāo)本獲取及組織切片HE染色和免疫組化染色 手術(shù)后第21天以過量麻醉方法處死全部大鼠。取下腹部正中切口(長(zhǎng)約4 cm)進(jìn)入腹腔，將大鼠腎臟、輸尿管和膀胱分離，提起膀胱底部，分離至尿道近端剪斷，取出腎、輸尿管、膀胱后，觀察臟器大小、表面色澤及結(jié)石形成的情況。獲取的尿路組織標(biāo)本立即置于4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋組織標(biāo)本，4 pm厚切片。(1)HE染色。切片常規(guī)用二甲苯脫蠟，經(jīng)各級(jí)乙醇醇化后水洗。蘇木素染色5 min，自來(lái)水沖洗。鹽酸、乙醇分化(提插數(shù)下)，自來(lái)水浸泡15 min或溫水(約50℃)浸泡5 min，伊紅染色2 min。常規(guī)脫水，透明封片，中性樹脂封固。(2)免疫組化染色。組織標(biāo)本脫蠟:60℃烤箱預(yù)熱30 min后，二甲苯脫蠟15 min，兩次。水化:依次置于 100%、100%、95%、85%、75%乙醇，蒸餾水中水化處理10 min。3%H2O2室溫孵育15 min后，1×PBS沖洗3次后，置于0.01 mmol·L－1枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)中煮沸15 min，蒸餾水浸泡30 min，1×PBS沖洗3次。滴加兔抗THP(H135)抗體(濃度1∶120)，37℃溫箱孵育60 min。滴加羊抗兔二抗，37℃孵育30 min，1×PBS沖洗3次。DAB顯色，自來(lái)水反復(fù)沖洗。蘇木素復(fù)染，封片。根據(jù)Tamm-Horsfall蛋白在髓攀升支粗段和遠(yuǎn)曲小管近段上皮細(xì)胞免疫組化著色度表達(dá)進(jìn)行評(píng)分(按照色度學(xué)準(zhǔn)則，分析免疫組化彩色圖像):著色度0～33%評(píng)1分，34% ～66%評(píng)2分，67% ～100%評(píng)3分。

2 結(jié) 果

造模術(shù)后第2天，實(shí)驗(yàn)組大鼠死亡2只，其他各組大鼠無(wú)死亡。解剖發(fā)現(xiàn)死亡原因?yàn)榇笫蟾骨恢匕Y感染合并尿潴留。術(shù)后第21天，以過量麻醉方法處死全部大鼠。肉眼觀察，空白對(duì)照組與假手術(shù)組的腎臟、輸尿管無(wú)明顯變化，膀胱內(nèi)無(wú)結(jié)石生成(圖1、2)。假手術(shù)組膀胱組織在穿刺點(diǎn)局部稍有增厚。實(shí)驗(yàn)組大鼠的雙側(cè)腎臟明顯增大、質(zhì)暗腫脹，腎表面可見數(shù)量不等的微小膿腫，個(gè)別腎臟可見較大膿腫突出腎臟表面。腎切面腎盂擴(kuò)大，黏膜充血、腫脹，腎盂內(nèi)可見膿性分泌物。輸尿管腫脹，內(nèi)見炎癥分泌物。膀胱表面的黏液層被破壞，膀胱壁明顯增厚，膀胱表面粗糙糜爛，散在潰瘍，局部可見到粟粒樣膿腫。膀胱內(nèi)見結(jié)石樣物質(zhì)(圖3)。實(shí)驗(yàn)組大鼠的組織病理學(xué)變化為腎小管細(xì)胞發(fā)生混濁腫脹，管腔中有紅細(xì)胞及白細(xì)胞管型，腎間質(zhì)有水腫，部分纖維化(圖4)。輸尿管上皮中度增生，管腔中見大量中性粒細(xì)胞，周圍間質(zhì)中見中性粒細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞(圖5)。膀胱組織血管廣泛性擴(kuò)張充血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并有組織細(xì)胞壞死，膀胱移行上皮呈廣泛性增生(圖3)。實(shí)驗(yàn)組腎臟Tamm-Horsfall蛋白在髓攀升支粗段和遠(yuǎn)曲小管近段的上皮細(xì)胞表達(dá)增高(圖6)。

圖1 空白對(duì)照組膀胱 HE×200Fig 1 The control group(bladder)HE×200

圖2 空白對(duì)照組腎臟 HE×200Fig 2 The control group(kidney)HE×200

圖3 實(shí)驗(yàn)組膀胱圖片 HE×200Fig 3 Experimental group(bladder)HE×200

圖4 實(shí)驗(yàn)組腎盂圖片 HE×200Fig 4 Experimental group(kidney)HE×200

圖5 實(shí)驗(yàn)組輸尿管圖片 HE×200Fig 5 Experimental group(ureteral)HE×200

圖6 實(shí)驗(yàn)組大鼠Tamm-Horsfall免疫組化染色 ×200Fig 6 Immunohistochemistry staining of Tamm-Horsfall protein pression in kidney of rat ×200

3 討 論

泌尿系結(jié)石形成的病因主要分為兩類，即代謝性和感染性結(jié)石，其中，感染性結(jié)石占5% ～15%［1］。感染性結(jié)石形成的先決條件是解脲酶微生物引起的持續(xù)性尿路感染［2-4］。成功地構(gòu)建感染性結(jié)石的動(dòng)物模型可以進(jìn)一步研究解脲酶微生物，及其脲酶對(duì)尿路上皮細(xì)胞造成損傷后所產(chǎn)生的一系列病理改變，以及尿路上皮細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)。細(xì)菌在尿路上皮的拓殖是尿路感染的基礎(chǔ)［5］。細(xì)菌的拓殖主要依靠其自身的黏附性，這種黏附性與細(xì)菌表面的纖毛有密切關(guān)系［5-6］。在無(wú)尿液膀胱輸尿管返流的情況下，奇異變形桿菌通過其表面的纖毛黏附于尿路上皮細(xì)胞的甘露糖，并通過趨化作用上行至腎臟，引起腎臟感染［7-9］。

目前，有關(guān)解脲酶陽(yáng)性菌引起的尿路上皮細(xì)胞損傷在感染性結(jié)石形成過程中的作用，及結(jié)石形成后所起的組織細(xì)胞變化的機(jī)制并不清楚。我們對(duì)感染性結(jié)石的動(dòng)物模型觀察發(fā)現(xiàn)，奇異變形桿菌引起的尿路組織病理學(xué)的損害主要表現(xiàn)為腎盂腎炎和膀胱炎。組織形態(tài)學(xué)變化為腎盂擴(kuò)大，黏膜充血、腫脹，部分腎實(shí)質(zhì)可見微小膿腫或錐形炎癥灶;輸尿管腫脹，其內(nèi)見炎癥分泌物;膀胱表面的黏液層被破壞，膀胱表面粗糙糜爛，膀胱壁明顯增厚，局部可見到粟粒樣膿腫，部分融合成片，膀胱內(nèi)有大量成形結(jié)石形成。腎臟病理學(xué)變化為腎小管細(xì)胞發(fā)生混濁腫脹，管腔中有紅細(xì)胞及白細(xì)胞管型，腎間質(zhì)有水腫，部分纖維化。膀胱組織血管廣泛性擴(kuò)張充血，大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，并有組織細(xì)胞壞死。膀胱移行上皮呈廣泛性增生。

奇異變形桿菌及其解脲酶產(chǎn)物對(duì)尿路的病理?yè)p害可能既是尿路感染所造成的結(jié)果，又參與了此后的結(jié)石的生成。細(xì)菌入侵腎臟后，可直接破壞腎盂黏膜及腎小管上皮，受損的上皮細(xì)胞壞死脫落后將使腎小管基底膜暴露，為細(xì)菌進(jìn)一步拓殖或尿液中結(jié)晶的附著提供了部位。死菌及其碎片可沉積在腎小管上皮表面而加重腎小管的損傷，脫落的上皮細(xì)胞可降解為膜碎片與活性下降或死亡的奇異變形桿菌在具有黏性糖蛋白聚集下可成為感染性結(jié)石形成的核心［6-8］。此外，受損的腎小管上皮細(xì)胞將發(fā)生結(jié)構(gòu)和病理變化，其表達(dá)的一些大分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)可發(fā)生質(zhì)和量的改變，從而影響感染性結(jié)晶的成核、聚集和滯留。已知的這些大分子物質(zhì)和蛋白質(zhì)有Tamm-Horsfall蛋白、尿凝血酶片段-1、CD44、骨橋蛋白、透明質(zhì)酸、磷脂酞絲氨酸、硫酸乙酞肝素、唾液酸、纖維連接蛋白、白細(xì)胞介素-6以及其他一些生化物質(zhì)，其中比較重要的是Tamm-Horsfall蛋白。

Tamm-Horsfall蛋白只在腎臟小管的亨利袢上升段和遠(yuǎn)曲小管近段的上皮細(xì)胞產(chǎn)生，與糖脂磷脂酰肌醇結(jié)合于腎小管管腔周圍［10］，并在一種蛋白酶分解后釋放于尿中，是尿液中最豐富的蛋白。許多炎癥性腎病與Tamm-Horsfall蛋白有關(guān)［11］。感染性結(jié)石引起的腎臟組織損傷可以導(dǎo)致Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)增高。我們觀察到，大鼠感染性結(jié)石模型中腎小管上皮細(xì)胞Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)明顯增高。在尿路炎癥的條件下，Tamm-Horsfall蛋白可能在對(duì)固有免疫細(xì)胞的激活的過程中扮演內(nèi)源性啟動(dòng)子的作用［12］。長(zhǎng)期以來(lái)，人們意識(shí)到Tamm-Horsfall蛋白可能在尿石的形成中起作用，但對(duì)其具有促進(jìn)晶體聚合還是抑制晶體聚合的作用存在爭(zhēng)議。其實(shí)，Tamm-Horsfall蛋白在尿中是一把雙刃劍，在敲除大鼠Tamm-Horsfall蛋白表達(dá)基因后，腎臟內(nèi)有草酸鈣結(jié)石的形成，此研究［10］結(jié)果表明，Tamm-Horsfall蛋白對(duì)草酸鈣結(jié)石的形成具有明顯的抑制作用。尿中尿素的濃度對(duì)Tamm-Horsfall有影響，其濃度增高可使Tamm-Horsfall蛋白黏性降低，溶解性增加;相反若尿素濃度降低，Tamm-Horsfall蛋白發(fā)生聚集，黏性增加且易形成凝膠，有利于成為結(jié)石形成的核心。

奇異變形桿菌及其解脲酶對(duì)尿路上皮細(xì)胞可以造成損傷，損傷后所產(chǎn)生的一系列病理生理改變以及細(xì)胞的適應(yīng)性反應(yīng)在感染性結(jié)石的形成中起了重要的作用。奇異變形桿菌、解脲酶及磷酸胺鎂結(jié)晶與尿路上皮細(xì)胞的相互作用是一個(gè)復(fù)雜過程。

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