張 麗 尹琳琳 李 林

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院藥物研究室神經(jīng)變性病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100053)

多發(fā)性硬化是一種慢性中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病，其病理表現(xiàn)為神經(jīng)纖維出現(xiàn)髓鞘變性、脫失和軸突變性等［1］。髓鞘是包裹在有髓神經(jīng)纖維軸突外的脂質(zhì)細(xì)胞膜，呈管狀結(jié)構(gòu)，為階段性，其主要成分為類(lèi)脂質(zhì)和蛋白質(zhì)［2］。雙環(huán)己酮草酰二腙(Cuprizone，CPZ)是一種選擇性銅離子螯合劑，小劑量能夠誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘脫失［3］，形成髓鞘細(xì)胞的少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡［4］，常作為誘導(dǎo)因子建立脫髓鞘動(dòng)物模型。髓鞘染色在病理診斷和研究中具有重要意義。本研究應(yīng)用Cuprizone誘導(dǎo)脫髓鞘小鼠模型，取腦后切片，分別以牢固藍(lán)(Luxol Fast Blue，LFB)和油紅O兩種染色方法觀察腦組織紋狀體和海馬2個(gè)斷面胼胝體髓鞘脫失狀況，比較染色方法的優(yōu)劣，為研究者提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型建立

6周齡C57BL/6系小鼠，雄性，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司〔合格證號(hào):SCXK(京)2006-0009〕，飼養(yǎng)于SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，自由進(jìn)食飲水。小鼠采用抽簽法隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組(n=3):對(duì)照組動(dòng)物采用正常飼料飼育;模型組用含0.2%Cuprizone粉末的飼料飼育4周。

1.2 藥品與試劑

Cuprizone、油紅O、牢固藍(lán)購(gòu)自Sigma公司。10%水合氯醛、0.9%氯化鈉注射液等由首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院制劑室提供。氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸、多聚甲醛、蔗糖等購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司。

1.3 主要儀器

冰凍切片機(jī)(Thermo公司，美國(guó));生物顯微鏡(Olympus公司，日本)。

1.4 取材

動(dòng)物用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛灌注固定，取腦組織放入含有30%蔗糖和4%多聚甲醛固定液中，沉降后再換一次固定液即可。

1.5 牢固藍(lán)(LFB)髓鞘染色法［5］

取腦組織，行連續(xù)冠狀面冰凍切片，片厚20 mm，各組取相同平面。將腦片置于0.1%LFB/95%乙醇溶液中避光浸染過(guò)夜;95%乙醇漂洗3次，去除表面多余染料;0.05%碳酸鋰水溶液內(nèi)分化;充分水洗;蘇木素染色1 min，鹽酸乙醇適度分色，自來(lái)水返藍(lán)，梯度乙醇脫水、二甲苯透明，封片。

1.6 油紅O髓鞘染色法［6］

取0.5%油紅O/異丙醇儲(chǔ)存液與蒸餾水按3∶2比例混勻，靜置10 min后過(guò)濾。將組織切片置于預(yù)先配制好的油紅O染液中10～15 min，60%乙醇分色，在Harris蘇木精染液中淡染30 s，鹽酸、乙醇適度分色，每步之間用水沖洗，鏡檢。撈片后室溫中放置稍干，甘油明膠封片。

2 結(jié)果

2.1 小鼠腦組織紋狀體切面牢固藍(lán)(LFB)與油紅O髓鞘染色結(jié)果

油紅O染色將正常對(duì)照組小鼠腦組織紋狀體斷面胼胝體染成紅色，與皮質(zhì)和紋狀體分界清晰(圖1A1)，Cuprizone模型組因髓鞘脫失，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)染成藍(lán)紫色(圖1B1)。牢固藍(lán)染色將正常對(duì)照組腦組織紋狀體斷面胼胝體染成亮藍(lán)色(圖1A2)，模型組殘存髓鞘染成藍(lán)色，炎性細(xì)胞為藍(lán)紫色，但與周?chē)M織分界不明顯(圖1B2)。

圖1 小鼠腦組織紋狀體斷面牢固藍(lán)與油紅O髓鞘染色Fig.1 Striatum section Luxol Fast Blue and oil red O staining in mouse(100×)

2.2 小鼠腦組織海馬切面牢固藍(lán)(LFB)與油紅O髓鞘染色

在小鼠腦組織海馬切面，牢固藍(lán)(LFB)與油紅O 2種髓鞘染色均可以清晰顯示胼胝體膝部和扣帶病理改變。正常對(duì)照組胼胝體分別呈紅色(油紅O染色，圖2A1)和亮藍(lán)色(牢固藍(lán)染色，圖2A2);Cuprizone模型組胼胝體髓鞘脫失嚴(yán)重，殘存髓鞘分別染成淡紅色(油紅O染色，圖2B1)和淡藍(lán)色(牢固藍(lán)染色，圖2B2)，以膝部尤為明顯(箭頭所示)。

圖2 小鼠腦組織海馬斷面牢固藍(lán)與油紅O髓鞘染色Fig.2 Brain hippocampus section Luxol Fast Blue and oil red O staining in mouse(100×)

3 討論

脫髓鞘疾病是以神經(jīng)髓鞘脫失為主要或始發(fā)病變的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，可發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周?chē)窠?jīng)系統(tǒng)，如多發(fā)性硬化、彌漫性硬化、急性播散性腦脊髓炎等。此類(lèi)疾病主要累及腦深部白質(zhì)、腦室等部位，磁共振(MRI)掃描信號(hào)異常［7］。Cuprizone動(dòng)物模型的病理表現(xiàn)為白質(zhì)髓鞘含量下降、軸索消失、少突膠質(zhì)細(xì)胞變性、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等［8］;電鏡觀察發(fā)現(xiàn)白質(zhì)內(nèi)髓鞘結(jié)構(gòu)分離和斷裂、線(xiàn)粒體腫脹變性等超微結(jié)構(gòu)改變［9］。

牢固藍(lán)(LFB)染色是脂溶性染料浸染法的一種，也是檢測(cè)中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)變化的常用方法。Luxol是國(guó)際上認(rèn)可的髓鞘染色劑，主要依據(jù)其在乙醇溶液內(nèi)可與髓鞘磷脂結(jié)合染色的特點(diǎn)，利用組織灰白質(zhì)在乙醇和碳酸鋰中對(duì)牢固藍(lán)結(jié)合力度不同，將灰質(zhì)染成淡藍(lán)色，白質(zhì)染成亮藍(lán)色，借助色差區(qū)分灰質(zhì)與白質(zhì)的界限。LFB方法常復(fù)染蘇木素以顯示組織結(jié)構(gòu)，細(xì)胞核染成藍(lán)紫色［10］。本實(shí)驗(yàn)中，在海馬冠狀面切片染色中，正常對(duì)照組胼胝體的髓鞘呈亮藍(lán)色，與皮質(zhì)、海馬分界清晰，髓鞘及組織結(jié)構(gòu)易于觀察;在紋狀體斷面，正常對(duì)照組層次清晰。但是，Cuprizone模型組因髓鞘大量丟失，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，經(jīng)蘇木素復(fù)染后，胼胝體部位藍(lán)紫色細(xì)胞核與牢固藍(lán)的亮藍(lán)色界限不明顯。油紅O屬于偶氮染料，是很強(qiáng)的脂溶劑和染脂劑。脂溶性染料能溶于組織和細(xì)胞中的脂類(lèi)，它在脂類(lèi)中的溶解度比在溶劑中大。當(dāng)組織切片置入染液時(shí)，染料則離開(kāi)染液而溶于組織內(nèi)的脂質(zhì)(如脂滴)中，使組織內(nèi)的脂滴呈橘紅色。本實(shí)驗(yàn)中，無(wú)論是海馬切面還是紋狀體切面，經(jīng)油紅O染色后均可將胼胝體與周?chē)Y(jié)構(gòu)清晰區(qū)分，紅色亮麗，與組織背景對(duì)比明顯。

在Cuprizone誘導(dǎo)的脫髓鞘小鼠模型中，通過(guò)牢固藍(lán)(LFB)與油紅O兩種髓鞘染色方法比較發(fā)現(xiàn)，兩種方法均可特異性地將海馬切面的胼胝體部位清晰區(qū)分，界限明顯，對(duì)神經(jīng)髓鞘具有良好的標(biāo)記作用;但在紋狀體切面油紅O法能更明顯區(qū)分周?chē)M織結(jié)構(gòu)。切片經(jīng)牢固藍(lán)染色后可通過(guò)二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片的步驟，適于長(zhǎng)期保存，但有些部位染色界限不夠明顯;而油紅O染色可避免此問(wèn)題。配制油紅O染液的異丙醇易揮發(fā)，對(duì)人體健康有害，染液產(chǎn)生沉淀，用前需過(guò)濾，每次染色時(shí)新鮮配制［11］;組織染色后需待略干后用甘油明膠封片，應(yīng)小心操作，避免組織結(jié)構(gòu)被破壞或有皺褶，影響鏡下觀察。

總之，牢固藍(lán)(LFB)與油紅O兩種髓鞘染色方法具有操作簡(jiǎn)單、特異性好、易于掌握等特點(diǎn)，是神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘等疾病可靠的實(shí)驗(yàn)方法，臨床及實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際工作需要選擇。

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