李 里，宮 亮，吳玉斌

1 材料與方法

1.1 材料 2011年5—12月選取清潔級(jí)Wistar大鼠48只，雄性，體質(zhì)量120～150 g，4～6周齡，均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 方法

1.2.1 分組 48只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，假手術(shù)組 (sham組)和模型組 (UUO組)各24只，每組術(shù)后3、7、14 d分為3組，每組8只。

1.2.2 動(dòng)物模型的制備 以10%的水合氯醛 (0.3 ml/kg)腹腔注射麻醉，于左側(cè)恥骨上切口，沿左腎下極尋找到左輸尿管，UUO組在輸尿管上用4號(hào)絲線上下結(jié)扎兩處，從中剪斷輸尿管，分層縫合后關(guān)閉腹腔;Sham組分離輸尿管不結(jié)扎，隨即縫合腹腔，完成手術(shù)。

1.2.3 標(biāo)本的采集和處理

1.2.3.1 尿 術(shù)后3、7、14 d收集24 h內(nèi)的新鮮尿樣，以離心半徑8 cm，3 000 r/min，離心15 min，除去沉渣，放置在－80℃的冰箱內(nèi)，檢測(cè)β2微球蛋白水平。

1.2.3.2 血術(shù)后3、7、14 d大鼠腹主動(dòng)脈采血4 ml，離心半徑8 cm，3 000 r/min，離心10 min，后置于－80℃冰箱保存，檢測(cè)血肌酐水平。

從圖譜中可以看出，我國(guó)武術(shù)文化研究的作者合作知識(shí)圖譜呈現(xiàn)集中—分散的狀態(tài)。每一個(gè)節(jié)點(diǎn)代表一個(gè)發(fā)文作者，節(jié)點(diǎn)大小代表作者發(fā)文數(shù)量的多寡，線條數(shù)量和粗細(xì)代表了作者之間的合作關(guān)系及強(qiáng)度。作者的科研能力與發(fā)文數(shù)量和載文期刊質(zhì)量成正比，科研團(tuán)隊(duì)合作不僅能夠促進(jìn)知識(shí)、資源共享，更有助于提高科研產(chǎn)出與學(xué)術(shù)影響力。

1.2.3.3 腎組織 術(shù)后3、7、14 d處死大鼠。留取左側(cè)腎組織，以無(wú)菌0.9%氯化鈉溶液沖洗，濾紙吸干表面水分，一部分置4%多聚甲醛中固定，制成冷凍切片，待做病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)和免疫組化。余下分離腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)，至－80℃冰箱，待做蛋白印跡 (Western blot)。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.3.1 腎功能檢測(cè) 全自動(dòng)生化分析儀 (中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院檢驗(yàn)科)檢測(cè)尿β2微球蛋白和血肌酐水平。

1.3.2 腎組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) 蘇木素－伊紅 (HE)染色，觀察腎小管間質(zhì)損傷的程度。

1.3.3 免疫組織化學(xué)染色 (SABC)法檢測(cè)腎皮質(zhì)PCNA、caspase－3的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)步驟按照說(shuō)明書進(jìn)行。PCNA抗體購(gòu)自北京生物技術(shù)公司。caspase－3(1∶40)為兔抗人多克隆抗體 (美國(guó)Zymed公司)，SABC試劑盒 (武漢博士德生物公司)。PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。結(jié)果判斷:PCNA細(xì)胞核染成棕褐色為陽(yáng)性反應(yīng)。caspase－3陽(yáng)性染色主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，少部分染于細(xì)胞核，呈棕黃色或棕褐色。

1.3.4 陽(yáng)性細(xì)胞百分率和平均灰度測(cè)定 應(yīng)用HPIAS－1000計(jì)算機(jī)病理圖文系統(tǒng)對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行分析。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)不重疊的高倍視野 (×400)，分別計(jì)腎小管、腎間質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞和陰性細(xì)胞數(shù)。陽(yáng)性細(xì)胞百分率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)÷(陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)+陰性細(xì)胞數(shù)) ×100%［3］。

1.3.5 Western blot法測(cè)定腎皮質(zhì)PCNA、caspase－3的相對(duì)表達(dá)量 取大鼠腎皮質(zhì)100 mg，加入裂解液 (上海吉?jiǎng)P公司提供)500 μl研磨，取出置 EP管中，離心半徑 8 cm，12 000 r/min，4℃，離心10 min，取上清液用BCA法檢測(cè)樣品蛋白質(zhì)水平。50 μg蛋白于SDS－聚丙烯酰胺凝膠中電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶封閉4℃過(guò)夜，分別加PCNA、caspase－3(1∶1 000) 以及內(nèi)參 β－actin，37℃ 2 h;洗膜3次，每次10 min;加HRP標(biāo)記羊抗兔IgG(1∶20 000，美國(guó)Santa Cruz提供)，37℃ 1 h，洗膜;將適量DAB顯色液平鋪在二抗雜交后的膜上，室溫放置觀察，可出現(xiàn)明顯的棕褐色蛋白顯色帶。半定量方法分析腎組織PCNA、caspase－3的表達(dá)，將膜上條帶掃描存入電腦，應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)軟件分析條帶的光密度，結(jié)果用β－actin校正。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組術(shù)后腎功能的改變 術(shù)后3、7 d兩組尿β2微球蛋白水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);術(shù)后14 d兩組尿β2微球蛋白水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)。術(shù)后3、7、14 d兩組血肌酐水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，見(jiàn)表1)。

表1 兩組術(shù)后腎功能的改變比較 (±s)Table 1 Comparison of renal function changes after operation between two groups

表1 兩組術(shù)后腎功能的改變比較 (±s)Table 1 Comparison of renal function changes after operation between two groups

組別 例數(shù) 尿β2微球蛋白 (μg/L)術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 14 d sham組 8 1.49±0.17 1.46±0.17 1.45±0.17 43±5 44±3 45±6血肌酐 (μmol/L)術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 術(shù)后UUO組 8 1.42±0.19 3.65±0.74 6.10±1.09 46±9 48±8 51±3 t 3.451 7.645 5.234 20.111 12.234 27.121 P值值0.065 0.076 0.049 0.071 0.085 0.067

2.2 腎組織形態(tài)學(xué)檢測(cè) HE染色顯示，sham組大鼠腎臟腎小管排列緊密、整齊;UUO組術(shù)后3 d，可見(jiàn)腎小管腫脹，部分腎小管輕度擴(kuò)張，小管間質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)炎性浸潤(rùn);術(shù)后7 d腎小管壁擴(kuò)張，腎間質(zhì)水腫;術(shù)后14 d腎小管結(jié)構(gòu)已經(jīng)完全被破壞，管腔塌陷 (見(jiàn)圖1)。

2.3 SABC法檢測(cè)PCNA、caspase－3的表達(dá)

2.3.1 PCNA在大鼠腎臟中的表達(dá)變化 PCNA陽(yáng)性染色主要分布于細(xì)胞核，染成棕黃色或棕褐色。sham組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞核在腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)極少。UUO組術(shù)后3、7、14 d PCNA在腎間質(zhì)細(xì)胞核表達(dá)明顯增加 (見(jiàn)圖2)。兩組術(shù)后3、7、14 d，腎小管內(nèi)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);腎間質(zhì)內(nèi)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表2)。

2.3.2 caspase－3在大鼠腎臟中的表達(dá)變化 caspase－3陽(yáng)性染色主要分布于細(xì)胞質(zhì)中，為棕黃色。sham組caspase－3在腎小管及腎間質(zhì)有少量表達(dá)，在UUO組表達(dá)增加，以腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)增加為主 (見(jiàn)圖3)。兩組術(shù)后3、7、14 d，腎小管內(nèi)caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);腎間質(zhì)內(nèi)caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表3)。

表2 兩組術(shù)后PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較 (±s，%)Table 2 Comparison of percentage of positive cells of PCNA protein expression between two groups

表2 兩組術(shù)后PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較 (±s，%)Table 2 Comparison of percentage of positive cells of PCNA protein expression between two groups

組別 例數(shù) 腎小管術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 14 d sham組 8 7.47±1.29 6.37±1.89 6.47±1.39 9.15腎間質(zhì)術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 術(shù)后±3.15 8.05± 4.51 6.15±3.10 UUO組 8 20.29±5.67 35.83±9.50 10.21±4.01 31.56±2.89 52.21±13.41 60.89±3.01 t 16.322 30.112 8.775 26.152 50.111 20.978 P值值0.062 0.058 0.065 0.021 0.034 0.011

2.4 Western blot法測(cè)定腎皮質(zhì)PCNA、caspase－3的相對(duì)表達(dá)量 Western blot法結(jié)果顯示，sham組腎皮質(zhì)中有微量PCNA、caspase－3的表達(dá);UUO組術(shù)后PCNA、caspase－3蛋白表達(dá)增加，梗阻時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加 (見(jiàn)圖4)。

表3 兩組術(shù)后caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較 (±s，%)Table 3 Comparison of percentage of positive cells of caspase－3 protein expression between two groups

表3 兩組術(shù)后caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞百分率比較 (±s，%)Table 3 Comparison of percentage of positive cells of caspase－3 protein expression between two groups

組別 例數(shù) 腎小管術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 術(shù)后14 d 14 d sham組 8 5.31±0.87 5.21±0.67 6.31±0.57 9.05腎間質(zhì)術(shù)后3 d 術(shù)后7 d 術(shù)后±2.24 8.05±2.24 9.15±1.24 UUO組 8 16.92±5.48 54.85±9.14 66.21±4.01 10.56±2.49 20.15±6.19 25.89±3.01 t 19.012 50.241 20.111 11.258 21.456 11.434 P值值0.035 0.045 0.021 0.014 0.023 0.041

圖1 腎組織形態(tài)學(xué)改變Figure 1 Histomorphology changes of the renal tissues

圖2 SABC法檢測(cè)PCNA的表達(dá)Figure 2 Expression of PCNA proteins by SABC method

圖3 SABC法檢測(cè)caspase－3的表達(dá)Figure 3 Expression of caspase－3 proteins by SABC method

圖4 PCNA、caspase－3的相對(duì)表達(dá)量Figure 4 Relative expression quantities of PCNA and caspase－3 proteins

3 討論

在引發(fā)嬰幼兒腎衰竭的病因中，尿路梗阻所引致的梗阻性腎病是極其常見(jiàn)的［3］。而腎纖維化則是所有梗阻性腎病病程最終的共同途徑。UUO是誘導(dǎo)腎纖維化最經(jīng)典的模型，該模型易于制作，具備良好的重復(fù)性和較高的成功率。在本研究中，通過(guò)HE染色觀察到尿路梗阻后腎小管擴(kuò)張、萎縮、管腔塌陷，腎間質(zhì)增寬等腎纖維化表現(xiàn)，表明UUO模型造模成功。

本實(shí)驗(yàn)采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)大鼠尿中β2微球蛋白水平，術(shù)后14 d UUO組較sham組明顯升高，表明術(shù)后14 d UUO組大鼠腎小管已經(jīng)受到明顯破壞，存在大量的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。由于β2微球蛋白的合成與分泌主要是通過(guò)淋巴細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)，因此，尿中β2微球蛋白的排出增加。

本實(shí)驗(yàn)血肌酐水平測(cè)定結(jié)果表明，兩組血肌酐水平無(wú)明顯差異，其原因可能是:本研究中損傷的大部分是腎小管，而腎小球功能的良好與否是通過(guò)血肌酐來(lái)反映的;另一方面在常用腎功能檢查的指標(biāo)中可應(yīng)用血肌酐指標(biāo)，但在腎功能損傷早期并不靈敏。

PCNA是DNA多聚酶的輔助蛋白，是DNA復(fù)制的必需物質(zhì)，其水平反映了細(xì)胞增殖程度［4］，是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，sham組PCNA陽(yáng)性細(xì)胞核在腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)極少。UUO組術(shù)后14 d PCNA在腎小管上皮細(xì)胞及腎間質(zhì)細(xì)胞核表達(dá)明顯增加。兩組術(shù)后14 d腎小管內(nèi)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分率無(wú)明顯差異，腎間質(zhì)內(nèi)PCNA陽(yáng)性細(xì)胞百分率差異明顯。PCNA的合成和表達(dá)的量與細(xì)胞增殖指數(shù)及細(xì)胞所處周期有關(guān)，已用于惡性腫瘤的診斷和判斷預(yù)后［5］。因此，PCNA可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的指標(biāo)［6］。

近年來(lái)關(guān)于梗阻性腎病的發(fā)病機(jī)制已經(jīng)在分子水平上研究，研究結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡參與輸尿管梗阻后的腎病理生理過(guò)程，caspase－3家族是細(xì)胞凋亡下游的關(guān)鍵酶，大多數(shù)觸發(fā)細(xì)胞凋亡的因素通過(guò)caspase－3介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑引發(fā)細(xì)胞凋亡［7］。本實(shí)驗(yàn)SABC法結(jié)果顯示，caspase－3在sham組腎小管及腎間質(zhì)有少量表達(dá)，在UUO組表達(dá)增加，以腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)增加為主。兩組術(shù)后14 d腎小管內(nèi)caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞百分率差異明顯。兩組術(shù)后14 d腎間質(zhì)內(nèi)caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞百分率有明顯差異。Western blot法結(jié)果顯示，sham腎皮質(zhì)中有微量caspase－3的表達(dá);UUO組術(shù)后caspase－3表達(dá)增加，梗阻時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加。提示caspase－3活性增強(qiáng)參與梗阻腎的病理生理過(guò)程。梗阻腎組織caspase－3表達(dá)隨梗阻時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，腎小管中表現(xiàn)更為明顯，說(shuō)明梗阻腎caspase－3表達(dá)增強(qiáng)是腎損傷、腎小管萎縮乃至腎衰竭的重要原因之一。這為在梗阻尚未解除時(shí)如何減輕或延緩腎功能損害以及梗阻解除后如何促進(jìn)腎功能恢復(fù)提供新的防治方向。

細(xì)胞增殖與細(xì)胞凋亡之間的平衡是維持腎臟正常結(jié)構(gòu)形成的關(guān)鍵，如何調(diào)控細(xì)胞凋亡，拮抗細(xì)胞增殖，阻止腎纖維化的進(jìn)一步發(fā)展有待進(jìn)一步研究。

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