曹 陽(yáng)，王文萍，郭雋馥，田振國(guó)

疼痛是癌癥患者特別是中晚期癌癥患者的主要癥狀，它比死亡更令患者恐懼和不安。阿片作為一類歷史悠久的鎮(zhèn)痛藥，嗎啡及其衍生物是臨床解除癌癥晚期疼痛的主要藥物。但是，嗎啡及其他阿片制劑長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致耐受性和依賴性，極大限制了其在臨床上的應(yīng)用。嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的機(jī)制已經(jīng)研究了很多年，但至今尚不十分清楚。已經(jīng)得到大多數(shù)人認(rèn)同的機(jī)制有:受體數(shù)目變化、內(nèi)吞;受體—蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)的活化;第二信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的代償機(jī)制;受體基因表達(dá)變化等［1］。目前臨床上并無(wú)十分有效的防治嗎啡耐受的西藥，臨床所用多為嗎啡受體阻斷劑和作用稍弱一些的阿片類似物，但有不良反應(yīng)多、降低嗎啡效果、產(chǎn)生新的依賴等問(wèn)題。用中藥來(lái)解決嗎啡在使用中出現(xiàn)的耐受現(xiàn)象，尚屬于相對(duì)的空白階段，但由于嗎啡的耐受和依賴是同一藥物作用下的兩種不同表現(xiàn)方式和階段，與之相比，中醫(yī)、中藥在解決藥物依賴方面已經(jīng)有200多年的歷史，且中藥具有多向調(diào)節(jié)、多功能、低毒無(wú)癮的優(yōu)勢(shì)。故本實(shí)驗(yàn)研究中藥復(fù)方對(duì)小鼠嗎啡鎮(zhèn)痛耐受的影響及其機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來(lái)源 選取2008年12月—2009年5月健康雄性昆明種小鼠30只 (由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，體質(zhì)量21～23 g，替換掉其中尾部有缺陷的，隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即嗎啡組 (M組)、嗎啡加中藥復(fù)方組 (MB組)、正常對(duì)照組，每組10只。在安靜、室溫、正常光照的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，在此期間各籠條件均等、自由攝食飲水、無(wú)不良條件影響，1周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與試劑 SHA－B恒溫水浴振蕩器 (常州國(guó)華電器有限公司)，MDF－136超低溫冰箱 (日本SANYO)，CM1900石蠟切片機(jī) (德國(guó)萊卡)，BS－51顯微鏡 (日本奧林帕斯)，WD－9413B紫外核酸分析系統(tǒng) (北京六一儀器廠)，TGL－20M臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (湘儀儀器有限公司)，gene analyse軟件 (北京六一儀器廠)。鹽酸嗎啡注射液 (沈陽(yáng)第一制藥廠，批號(hào)070705，0.5 ml∶5 mg)，大黃、木香等中藥 (購(gòu)自遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院眾意愿大藥房，藥材由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)任艷玲教授鑒定)，兔抗PKA(由武漢博士德生物工程有限公司提供，產(chǎn)品編號(hào)BA1354)，DAB顯色試劑盒 (由武漢博士德生物工程有限公司提供，產(chǎn)品編號(hào)AR1022)，SABC免疫組化染色試劑盒 (由武漢博士德生物工程有限公司提供)。

1.3 方法

1.3.1 中藥復(fù)方制備 精確稱取大黃75 g、木香50 g、當(dāng)歸100 g，按下述操作濃縮至90 ml(2.5 g/ml)。當(dāng)歸加木香提取揮發(fā)油后的藥液，水煎2次，1 h/次，合并煎液繼續(xù)濃縮。木香用水回流裝置提取揮發(fā)油 (提取揮發(fā)油所剩藥液回收后與當(dāng)歸混合)。大黃水煎15 min并濃縮，按1∶1.5加入5%明膠，放置30 min后過(guò)濾，濾液中加入3～5倍的乙醇，過(guò)濾，除去明膠，濾液在70℃環(huán)境中使乙醇揮發(fā)完全。以上3種藥液混合，濃縮至90 ml(2.5 g/ml)。

1.3.2 嗎啡耐受模型的建立與給藥 小鼠飼養(yǎng)1周后開(kāi)始給藥，M組每12 h皮下注射嗎啡10 mg/kg;MB組每12 h皮下注射嗎啡10 mg/kg并給予中藥復(fù)方0.2 ml/只。以上各組均給藥1周共15次。對(duì)照組未做任何處理。

1.4 甩尾潛伏期 (TFL)的測(cè)定 參照Yang等［2］的方法:第1次給藥前測(cè)量各組的基礎(chǔ)TFL。具體方法如下:將小鼠放入小鼠固定器中習(xí)慣5～10 min，將鼠尾末端3 cm置入52℃熱水中，測(cè)量小鼠尾部置入瞬間至甩出作用時(shí)間。隔5 min再測(cè)1次，取兩次平均值作為T(mén)FL。為避免燙傷，最長(zhǎng)時(shí)間設(shè)為20 s，超過(guò)20 s以20 s計(jì)。隨后，分別在第1、3、6、9、12、15次給藥半小時(shí)后重復(fù)上述方法。

1.5 PKA免疫組化染色 待最后一次給藥并測(cè)定TFL后，立即于冰面上固定小鼠四肢，與左心室內(nèi)注射4%多聚甲醛，直到小鼠尾部直硬，說(shuō)明小鼠腦組織已經(jīng)固定。立刻剪下小鼠頭部，取出腦皮質(zhì)約100 mg用0.1低鈉磷酸鹽緩沖液 (MPBS)固定30～60 min→5℃組織脫水→包埋﹑切片→58～60℃烘烤→常規(guī)脫蠟至水→滅火內(nèi)源性酶→熱修復(fù)抗原→滴加5%牛血清蛋白封閉液 (BSA)→遞加稀釋的一抗 (兔抗IgG)→滴加生物素化山羊抗小鼠IgG→DBA顯色→蒸餾水洗、脫水、透明、樹(shù)脂膠封片。利用奧林巴斯BS－51顯微鏡40倍物鏡進(jìn)行觀察、拍照。每張片子采集2個(gè)高倍視野圖像，進(jìn)行平均光密度測(cè)定。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，計(jì)量資料以 (±s)表示，采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 M組和MB組不同時(shí)間TFL比較 M組與MB組給藥前、第1次、第3次給藥后TFL比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＞0.05);兩組第6次、第9次、第12次、第15次給藥后TFL比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05，見(jiàn)表1)。

表1 M組和MB組不同時(shí)間TFL比較 (±s，s)Table 1 Comparison of TFL of different time between two groups

表1 M組和MB組不同時(shí)間TFL比較 (±s，s)Table 1 Comparison of TFL of different time between two groups

組別 只數(shù) 給藥前 第1次 第3次 第6次 第9次 第12次 第15次47 9.40±0.19 7.52±0.33 6.44±0.39 MB組 10 4.22±0.43 16.65±1.01 16.21±0.40 15.14±0.37 13.27±0.45 10.44±1.02 8.81±1.18 t M組 10 4.30±0.49 16.59±0.83 16.18±0.46 14.04±1.1.333 0.333 0.500 2.717 3.148 2.651 2.631 P值值0.264 0.835 0.613 0.017 0.011 0.035 0.041

2.2 PKA免疫組化染色結(jié)果 正常小鼠腦皮質(zhì)免疫組化染色顯示PKA幾乎沒(méi)有表達(dá)，M組PKA表達(dá)有所增多，MB組小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)PKA明顯增多 (見(jiàn)圖1)。M組PKA染色平均光密度值為 (0.3492±0.0055)，MB組為 (0.3230±0.0096)，二者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=2.83，P＜0.05)。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，中藥復(fù)方對(duì)小鼠嗎啡耐受形成有抑制作用，同時(shí)使用嗎啡和中藥復(fù)方可以取得更好的鎮(zhèn)痛效果。并且使用嗎啡和中藥復(fù)方的小鼠皮質(zhì)中PKA明顯低于單獨(dú)使用嗎啡的小鼠，這與前面TFL統(tǒng)計(jì)結(jié)果相一致，并進(jìn)一步證明中藥復(fù)方抑制小鼠嗎啡耐受形成的機(jī)制可能與拮抗了嗎啡對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)的影響有關(guān)。

圖1 PKA免疫組化染色結(jié)果Figure 1 Immunohistochemical results of PKA

祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為阿片辛香苦澀性溫，入十二經(jīng)，功能行氣止痛，發(fā)散走竄，斂肺止咳，固精止遺，澀腸止瀉，有良好的臨床療效［3］。同時(shí)，阿片還有提攜氣血的興奮作用。多服久用阿片會(huì)導(dǎo)致成癮證。祖國(guó)醫(yī)學(xué)關(guān)于阿片耐受和依賴的病機(jī)理論主要有氣三焦受癮說(shuō)、血津液受損說(shuō)、膜原受邪說(shuō)、五臟六腑受癮說(shuō)、煙蟲(chóng)說(shuō)等［4］幾方面，其形成的主要機(jī)制是，煙毒內(nèi)蘊(yùn)，氣血津液受損，毒淤互阻，臟腑陰陽(yáng)失調(diào)，損陰及陽(yáng)，氣血淤滯，而見(jiàn)虛實(shí)互見(jiàn)，寒熱錯(cuò)雜，諸病叢生的復(fù)雜病證。這些理論歷經(jīng)數(shù)百年的實(shí)踐檢驗(yàn)與不斷完善，為治療提供了充實(shí)的理論依據(jù)。嗎啡耐受和依賴是同一藥物作用下的兩種不同表現(xiàn)方式和階段，而中醫(yī)、中藥在解決藥物依賴方面已經(jīng)有200多年的歷史。中醫(yī)藥學(xué)在長(zhǎng)期的實(shí)踐中逐漸形成了一套源于中醫(yī)辨證論治理論，同時(shí)又以扶正祛邪為主要特色的治療原則。目前，用于對(duì)抗嗎啡耐受和依賴的中藥主要有清熱解毒類的中藥及補(bǔ)氣扶正、解痙鎮(zhèn)痛類的中藥。

由于嗎啡耐受機(jī)制是多系統(tǒng)的、復(fù)雜的，不能指望單靶點(diǎn)的藥物從根本上解決問(wèn)題，所以中藥的多系統(tǒng)、多靶點(diǎn)作用越來(lái)越受到青睞。但同時(shí)也存在著復(fù)方制劑藥味多、處方龐大、基礎(chǔ)研究薄弱、有效成分與無(wú)效成分混雜、劑型過(guò)于單一、質(zhì)量難以控制等問(wèn)題，同時(shí)也難以對(duì)藥物進(jìn)行深入的機(jī)制研究。基于以上，結(jié)合我國(guó)國(guó)情，發(fā)揮中醫(yī)藥的優(yōu)勢(shì)，必須用現(xiàn)代的科技方法從中藥或復(fù)方中尋找治療嗎啡耐受的有效成分，進(jìn)行深入研究，以研制出新藥物用于臨床，這也是中醫(yī)藥向現(xiàn)代化發(fā)展的要求。

1 Mercadante S，F(xiàn)ulffaro F.World Health Organization guidelines for cancer pain:a reappraisal［J］.Ann Oncol，2005，16(Suppl 4):132－135.

2 Yang W，Law PY，Guo X，et al.In vivo activation of a mutant muopioid receptor by antagonist:Future direction for opiate pain treatment paradigm that lacks undesirable side effect［J］.Proc Natl Acad Sci UAS，2003，1004(4):2117－2121.

3 宋樹(shù)立，高學(xué)敏.中醫(yī)辨證戒毒理論［J］.中國(guó)藥物依賴性雜志，2000，9(3):170－171

4 朱偉.阿片類藥物依賴的中醫(yī)認(rèn)識(shí)與探討 ［J］.江西中醫(yī)藥，2002，10(5):29－30.