梁媛媛

（杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江杭州311121）

含納米Au粒子的生物電極的制備及其生物電催化性能研究

梁媛媛

（杭州師范大學(xué)生物醫(yī)藥與健康研究中心，浙江杭州311121）

以殼聚糖為模板，采用檸檬酸為還原劑，通過原位負(fù)載方法制備了含有金（Au）納米粒子的殼聚糖／Au／葡萄糖氧化酶（GOD）復(fù)合生物電極.利用掃描電鏡對該生物電極的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，結(jié)果顯示Au納米粒子的平均粒徑為15 nm，均勻分布于殼聚糖膜內(nèi).將該復(fù)合電極用于葡萄糖的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GOD在復(fù)合膜中具有良好的生物催化活性，對葡萄糖有快速靈敏的響應(yīng)，線性范圍為0～30 mmol·L－1，線性相關(guān)系數(shù)大于0.998 8，檢出限為32μmol·L－1（S／N＝3）.

殼聚糖；Au納米粒子；葡萄糖氧化酶電極

0 前 言

化學(xué)與生物傳感器因在臨床分析、食品工業(yè)及環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域中具有很大的應(yīng)用潛力而日益受到關(guān)注.酶的高選擇性及對底物的專一、快速響應(yīng)使得酶電極成為研究最廣泛的生物傳感器.近年來，人們發(fā)現(xiàn)當(dāng)用納米材料對電極進(jìn)行修飾時，不僅可將材料本身的理化性質(zhì)引入電極界面，同時也會提高電極的比表面積，從而對某些物質(zhì)的電化學(xué)行為產(chǎn)生特有的催化效應(yīng)；另外還可以降低過電位，提高電化學(xué)反應(yīng)速率以及電極的選擇性和靈敏度等，能測定多種具有電活性和非電活性的物質(zhì)［1－2］.金（Au）納米粒子具有良好的生物相容性，并且具有良好的導(dǎo)電功能，將金納米粒子引入到酶生物電級中可以促進(jìn)酶與電極的電子轉(zhuǎn)移，使得酶的活性中心與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移成為可能［3］.殼聚糖（CHI）具有優(yōu)異的成膜性、極強(qiáng)的吸附能力、良好的生物相性，使其在近年來成為固定生物分子的優(yōu)良材料.由于其帶有豐富的氨基，殼聚糖對納米粒子具有特殊的吸附作用［4］，可作為納米粒子原位形成的基質(zhì).

因此，本研究擬制備一種基于納米Au／殼聚糖有機(jī)－無機(jī)復(fù)合膜作為固定基質(zhì)的酶生物傳感器.該復(fù)合膜具備高比表面積、對蛋白的高親和作用以及有機(jī)基質(zhì)殼聚糖成膜性好、膜機(jī)械強(qiáng)度高等一系列優(yōu)點，能實現(xiàn)對酶的高負(fù)載與固定化，最終得到靈敏度高、響應(yīng)速度快、穩(wěn)定性好的生物傳感器，并且此基質(zhì)也可用于其它生物分子的固定.

1 實驗部分

1.1 試劑

殼聚糖：上海晶純試劑公司；葡萄糖氧化酶（GOD，EC 1.1.3.4，2.500 5μkat·mg－1）：上海博奧生物試劑公司；葡萄糖：上海國藥化學(xué)試劑公司；氯金酸：Sigma公司；其他試劑均為分析純試劑.

1.2 納米Au粒子的制備

在10 m L質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的殼聚糖醋酸溶液中加入0.5 mol·L－1的氯金酸100μL并混勻，在不斷振搖下加入1 mol·L－1的檸檬酸溶液200μL，溶液逐漸轉(zhuǎn)化為溶膠，所制備的納米Au溶膠的顏色為粉紅色，在室溫下靜置反應(yīng)2 h，備用.

1.3 含納米Au粒子的CHI／Au／GOD復(fù)合電極的制備

用微量取樣器吸取5μL上述Au溶膠并涂滴于光潔的玻碳電極表面，在室溫下晾干后將玻碳電極放入p H 7.0的PBS溶液中浸泡過夜.然后，將5μL GOD溶液（p H＝7.0，5 mg·m L－1）滴涂在Au納米粒子層上，置入4℃冰箱中晾干，備用.所得傳感器的表面形貌用掃描電子顯微鏡（AUM，1 530VP，德國LEO公司）表征，傳感器的電化學(xué)測試在CHI630A電化學(xué)工作站（上海辰華公司）上進(jìn)行（24℃恒溫），采用的三電極系統(tǒng)由鉑絲對電極、飽和甘汞參比電極以及制備的GOD傳感器工作電極構(gòu)成，0.02 mol·L－1PBS為電解液.

圖1 CHI／Au／GOD復(fù)合電極的表面微結(jié)構(gòu)Fig.1 SEM micrographs of CHI／Au／GOD

2 結(jié)果與討論

2.1 Au納米粒子的結(jié)構(gòu)與表征

殼聚糖長鏈的存在可以控制Au納米粒子的生長，防止納米粒子之間相互作用發(fā)生團(tuán)聚，有利于生物電極具有良好的導(dǎo)電功能以及酶分子的均勻負(fù)載.圖1是CHI／Au／GOD復(fù)合膜的掃描電鏡圖，從圖中可以看出Au納米粒子均勻地分散于基質(zhì)中，粒徑為15 nm左右.

2.2 含納米Au粒子的CHI／Au／GOD電極的電化學(xué)行為

圖2a顯示了CHI／Au／GOD復(fù)合膜修飾電極在K4Fe（CN）6的PBS緩沖溶液中（0.02 mol·L－1，p H 7.0）不同掃描速度下的循環(huán)伏－安曲線.從圖中可知，在－0.2～0.6 V范圍內(nèi)均有一對可逆的氧化還原峰出現(xiàn)，掃描速度為100 m V· s－1時，其勢電位為標(biāo)準(zhǔn)式量電位即E1／2為0.27 V（vs SCE），與鐵氰化鉀標(biāo)準(zhǔn)式量電位相近，表明該峰對應(yīng)鐵氰化鉀的特征氧化－還原反應(yīng).陰極電流和陽極電流的比值為0.996，說明該電極反應(yīng)具有良好的可逆性和快速的電子傳遞特性.

隨著掃描速度從25 m V·s－1增加到300 m V·s－1，氧化還原峰電流與掃描速度成正比（圖2 b），表現(xiàn)出表面控制反應(yīng)過程.已知在薄層循環(huán)伏安電化學(xué)中，對循環(huán)伏安還原峰進(jìn)行積分，可以得到薄膜中的電活性物質(zhì)在電極發(fā)生還原時所消耗的電荷Q.將其代入法拉第公式Q＝n FAΓ＊，就可以得到電活性物質(zhì)的表面濃度（Γ＊，mol·cm－2），這里的n代表電活性物質(zhì)發(fā)生電極反應(yīng)時的電子轉(zhuǎn)移數(shù)，F(xiàn)為法拉第常數(shù)，A為電極面積（cm2）.由此可以估算出薄膜中GOD的表面濃度為3.52×10－9mol·cm－2，而當(dāng)GOD為單分子層吸附時其表面濃度的理論值為1.7×10－12mol·cm－2［5］，這說明Au納米粒子在復(fù)合膜中是多層吸附的.

圖2 CHI／Au／GOD電極在1.0 mol·L－1K4Fe（CN）6的PBS（0.02 mol·L－1，p H 7.0）溶液中的電化學(xué)行為Fig.2 The electrochemical behavior of CHI／Au／GOD in 0.02 mol·L－1PBS（pH 7.0）containing 1.0 mmol·L－1K4Fe（CN）6

圖3所示為利用循環(huán)伏安法考察所得CHI／Au／GOD復(fù)合膜修飾電極對葡萄糖的電催化性質(zhì).當(dāng)溶液中加入葡萄糖后，可以觀察到氧化還原峰發(fā)生了明顯的變化，表現(xiàn)為氧化峰增強(qiáng)、還原峰減弱，具有典型的電催化特性，表明固定在電級上的GOD具有良好的生物活性，在K4Fe（CN）6的作用下，能可逆地進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，其催化原理可用下式表達(dá)：其中，GO（FAD）和GO（FADH2）分別為葡萄糖氧化酶的氧化型和還原型；G和GL分別代表葡萄糖和葡萄糖酸內(nèi)酯.即擴(kuò)散入膜的G被GOD氧化生成GL，GOD本身也從GO（FAD）轉(zhuǎn)化為GO（FADH2）（式2）.此時，還原型的GO（FADH2）被溶液中的［Fe（CN）6］3－氧化（式3），再次轉(zhuǎn)化為GO（FAD）.［Fe（CN）6］4－進(jìn)一步在電極表面失去電子，產(chǎn)生氧化電流（式1）.通過這一過程，GOD上的電子成功地傳遞到電極上，其本身在反應(yīng)過程中得到再生，可以用來連續(xù)催化葡萄糖的氧化，得到氧化峰增強(qiáng)、還原峰減弱的催化循環(huán)伏安圖.

圖4為在PBS（0.02 mol·L－1，p H7.0）溶液中CHI／Au／GOD復(fù)合膜修飾電極響應(yīng)電流隨葡萄糖濃度的變化曲線.從圖中可以看出，當(dāng)葡萄糖濃度低于30 mol·L－1時，與電流值的增量成線性關(guān)系，線性回歸方程為Ip（μA）＝0.097C（mmol·L－1）＋2.565（R＝0.998 8），檢出限是32μmol·L－1（S／N＝3）.當(dāng)葡萄糖濃度較低時，電極的穩(wěn)態(tài)響應(yīng)電流和葡萄糖濃度呈線性關(guān)系.當(dāng)葡萄糖濃度較大時，響應(yīng)電流和葡萄糖濃度無關(guān)，符合Michaelis－Menten的動力學(xué)關(guān)系.根據(jù)Lineweaver－Burk方程［6］：

1／Iss＝1／Imax＋Kampp／（Imaxc），

式中，Iss為加入一定底物濃度時的穩(wěn)態(tài)電流，Imax為底物達(dá)到飽和時的最大（極限）電流，c為與Iss對應(yīng)的底物濃度.以1／Iss對1／c作圖，由其截距和斜率即可求得米氏常數(shù)Kampp為10.2 mmol·L－1，與文獻(xiàn)報道值接近［7］，說明GOD在復(fù)合膜中保持了良好的生物活性.

3 結(jié) 論

本文通過原位負(fù)載法獲得了CHI／Au／GOD復(fù)合膜修飾電極，Au納米粒子的平均粒徑為15 nm，均勻分布于殼聚糖膜內(nèi)，GOD的表面濃度為3.52×10－9mol·cm－2，呈多層吸附狀態(tài)；該電極反應(yīng)具有良好的可逆性和快速的電子傳遞特性，將其用于溶液中葡萄糖的檢測，結(jié)果表明該修飾電極對葡萄糖有快速靈敏的響應(yīng)，線性范圍為0～30 mmol·L－1，線性相關(guān)系數(shù)大于0.998 8，檢出限為32μmo L·L－1（S／N＝3）.本工作的開展為葡萄糖檢測提供了一種新型的基于生物電催化性能的傳感器，也拓寬了納米顆粒在生物傳感器中的應(yīng)用前景.

［1］姜靈彥，劉傳銀，蔣麗萍，等.納米材料修飾電極及其在電分析化學(xué)中的應(yīng)用［J］.化學(xué)研究與應(yīng)用，2004，16（5）：615－618.

［2］金利通，鮮躍仲.基于納米材料的化學(xué)與生物傳感器研究進(jìn)展［J］.化學(xué)傳感器，2006，26（1）：3－12.

［3］Murray R W.Nanoelectrochemistry：metal nanoparticles，nanoelectrodes，and nanopores［J］.Chemical Reviews，2008，108（7）：2688－2720.

［4］蔣挺大.殼聚糖［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2007：189－192.

［5］Bourdillon C，Demaille C，Gueris J，et al.A fully active monolayer enzyme electrode derivatized by antigen－antibody attachment［J］.Journal of the American Chemical Society，1993，115（26）：12264－12269.

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Research on the Preparation and Bioelectrocatalysis Property of Bioelectrode with Au Nanoparticle

LIANG Yuan－yuan
（Research Center of Biomedicine and Health，Hangzhou Normal Universtiy，Hangzhou 311121，China）

The chitosan／Au／glucose oxidase electrode complex bioelectrode with Au nanoparticles was prepared by the in－site supported method with chitosan as the formwork as well as citric acid as the reducing agent.Characterizing the structure of the bioelectrode with the scanning electron microscope，the results show that the mean diameter of the Au nanoparticles is about 15 nm，which distribute evenly in the chitosan.Detecting glucose with the bioelectrode，the results show that GOD has favorable biocatalysis activity in complex film as well as rapid and sensitive response to glucose，the linear range is 0 to 30μmol·L－1，the correlated coefficient is greater than 0.998 8，and the detection limit is 32μmol·L－1（S／N＝3）.

chitosan；Au nanoparticles；glucose oxidase electrode

0657.14

A

1674－232X（2012）03－0222－04

10.3969／j.issn.1674－232X.2012.03.006

2011－12－14

杭州市科技計劃發(fā)展項目（KH10364）；杭州師范大學(xué)科研啟動項目（PD10002004001040）.

梁媛媛（1980—），女，助理研究員，博士，主要從事多功能納米復(fù)合材料研究.E－mail：liangyy＠hznu.edu.cn