張曉艷，寧喜斌

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

響應(yīng)面法優(yōu)化溶藻弧菌的培養(yǎng)條件

張曉艷，寧喜斌*

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海201306）

通過單因素實(shí)驗(yàn)確定pH、溫度、鹽度三個(gè)因素下溶藻弧菌的最優(yōu)培養(yǎng)條件。根據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)原理進(jìn)行響應(yīng)面分析，以菌液的OD600為響應(yīng)值，確定影響溶藻弧菌培養(yǎng)的各因素水平。結(jié)果表明，最優(yōu)培養(yǎng)條件為pH7.62、溫度34.55℃、鹽度3.22%；菌體生長過程中pH和溫度、溫度和鹽度對(duì)V.a ATCC17749生長的交互作用顯著。

溶藻弧菌，Box-Behnken，響應(yīng)面，培養(yǎng)條件

Abstract：According to singe-factor experiments，three levels factors including the pH，temperature and salinity were selected to evaluate the optimum culture condition of Vibrio alginolyticus.Based on Box-Behnken central composite design principle of the Response Surface Methodology（RSM），the OD600was chosen as response value to determine the range of factors and levels.With the results，the optimized conditions of cultivation were as follows：pH7.62，temperature 34.55℃ and salinity 3.22% ，respectively.During the germination significant interactions between pH and temperature，as well as temperature and salinity were found.

Key words：Vibrio alginolyticus；Box-Behnken；response surface methodology（RSM）；culture condition

溶藻弧菌存在于多種海洋動(dòng)物體內(nèi)及海域水體中，是魚、蝦、貝類等海水養(yǎng)殖動(dòng)物的致病菌[1-3]。其致病性大多發(fā)生在夏季，另外動(dòng)物體免疫機(jī)能下降或者環(huán)境條件惡化時(shí)也容易發(fā)生[4]，同時(shí)，溶藻弧菌為人和水生動(dòng)物共患的病原菌，可以引起食物中毒、敗血癥及中耳炎等[5]。近幾年來，國內(nèi)不少地方也不斷報(bào)道了關(guān)于溶藻弧菌引起食物中毒的事件。2004年7月24日赤峰市某酒店發(fā)生了一起集體共同食用未經(jīng)煮熟煮透的鹽水蝦而引起的溶藻弧菌中毒事件[6]；2006年，龍?zhí)秴^(qū)某村17名村民發(fā)生胃腸道疾病，經(jīng)現(xiàn)場衛(wèi)生學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，證實(shí)了是一起溶藻弧菌引起的食物中毒事件[7]。本文以溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株V.a ATCC17749為研究對(duì)象，測定pH、溫度、鹽度三個(gè)因素下改菌的生長變化，應(yīng)用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行響應(yīng)面分析，得到該菌的最合適的培養(yǎng)條件。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株 溶藻弧菌標(biāo)準(zhǔn)菌株V.a ATCC17749；革蘭氏陰性桿菌增菌液 杭州天和微生物試劑有線公司；蛋白胨、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）、營養(yǎng)肉湯、副溶血性弧菌增菌液、GN增菌液 上海市疾病預(yù)防控制中心。

臺(tái)式pH精密測試儀 德國WTW；UV2300分光光度計(jì) 上海天美科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 營養(yǎng)肉湯、GN、TSB、堿性蛋白胨水及副溶血性弧菌增菌液各100mL，分裝于11支試管中滅菌，取一環(huán)培養(yǎng)10h后的V.a接種，37℃培養(yǎng)，每隔1h測定OD600。

1.2.2 菌體生長的測定 V.a培養(yǎng)10h后，根據(jù)1.2.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取最優(yōu)培養(yǎng)基，取一環(huán)接種于5mL含3%NaCl的該培養(yǎng)基中，做2組平行，培養(yǎng)后在600nm處測定其吸光值。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 不同pH對(duì)V.a生長的影響 以HCl或NaOH溶液將5mL的含3%NaCl的優(yōu)選培養(yǎng)基的pH分別調(diào)為5.00、6.00、7.00、7.50、8.00、8.50、9.00、9.50和10.00。取一環(huán)V.a接種后37℃培養(yǎng)，每間隔1h取樣，連續(xù)取樣11次，600nm下測吸光度，優(yōu)選適合V.a生長的pH的范圍。

1.2.3.2 不同溫度（T）對(duì)V.a生長的影響 取一環(huán)V.a接種于5mL的含3%NaCl的優(yōu)選培養(yǎng)基中，分別在15、20、25、30、35、37、40、45℃下培養(yǎng)，每隔1h取樣，連續(xù)取樣11次，600nm下測吸光度，優(yōu)選適合V.a生長的溫度范圍。

1.2.3.4 不同鹽度（S）對(duì)V.a生長的影響 優(yōu)選培養(yǎng)基中添加不同量NaCl，使其最終鹽濃度達(dá)到1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%。取一環(huán)V.a接種后37℃下培養(yǎng)，每隔1h取樣，連續(xù)取樣11次，600nm下測吸光度，優(yōu)選適合V.a生長的鹽度范圍。

1.2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn) 通過對(duì)影響V.a生長的單因素分析，確定在單因素條件下適合V.a生長的pH、溫度及鹽度范圍，再用3因素3水平的響應(yīng)面分析，優(yōu)化其生長條件，以溶藻弧菌OD600為響應(yīng)值（R），實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表1，并在此最佳生長條件下，測定培養(yǎng)8h后的OD600，平行做3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，證實(shí)響應(yīng)面分析方法的可靠性。

表1 響應(yīng)面三因素三水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experiment design of 3 factors and 3 levels of response surface method

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基的優(yōu)化選擇

V.a ATCC17749在5種不同增菌液中的生長趨勢見圖1。其中在堿性蛋白胨水中基本不生長，在營養(yǎng)肉湯、GN及副溶血性弧菌增菌液中生長緩慢，在GN增菌液中10h后OD600值才大于1.0，在TSB中生長速度較快，延滯期最短，培養(yǎng)5h左右OD600即大于1.00。因此在單因素實(shí)驗(yàn)中均采用TSB。

圖1 不同培養(yǎng)基對(duì)V.a ATCC17749生長的影響Fig.1 Growth of V.a ATCC17749 in different medias

2.2 不同條件下培養(yǎng)V.a的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 pH對(duì)V.a生長的影響 如圖2所示，在pH為5.0和10.0時(shí)，V.a基本不生長，在pH為6.0、9.0和9.5時(shí)，V.a生長緩慢，在pH 7.0～8.5時(shí)，V.a生長較快，6h時(shí)OD600均大于1.0，因此，pH7.0～8.5為V.a最適生長條件。

2.2.2 溫度（T）對(duì)V.a生長的影響 在不同溫度條件下V.a的生長結(jié)果見圖3。V.a在15、45℃條件下基本不生長，在20、25℃時(shí)生長緩慢且延滯期較長，在7h后進(jìn)入對(duì)數(shù)期，溫度在30～40℃時(shí)，V.a生長較快，30℃延滯期為4h，35、37℃延滯期為3h，40℃延滯期縮短為2h，但是40℃在5h后進(jìn)入穩(wěn)定期。因此，選擇溫度30～37℃為V.a最適生長條件。

圖2 pH對(duì)V.a ATCC17749生長的影響Fig.2 Effect of the pH on growth of V.a ATCC17749

圖3 溫度對(duì)V.a ATCC17749生長的影響Fig.3 Effect of the temperature on growth of V.a ATCC17749

2.2.3 鹽度（S）對(duì)V.a生長的影響 在不同鹽度條件下V.a的生長結(jié)果見圖4。鹽度7%～10%時(shí)，V.a基本不生長，鹽度6%時(shí)生長比較緩慢，鹽度1%～5%時(shí)適宜V.a的生長，但在2%～4%鹽度下延滯期較短。因此，選擇鹽度2%～4%為V.a最適生長條件。

圖4 鹽度對(duì)V.a ATCC17749生長的影響Fig.4 Effect of the salinity on growth of V.a ATCC17749

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.3.1 Box-Behnken交互實(shí)驗(yàn)方案及實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)分析方案及結(jié)果見表2。從中可以看出預(yù)測值與實(shí)測值比較接近，偏差小于6.36%，表明本實(shí)驗(yàn)因素水平取值比較適當(dāng)。

采用Design-Expert軟件對(duì)響應(yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合后，得到回歸方程：Y=1.58+0.019A+0.045B+0.011C+0.038AB+0.010AC+0.052BC-0.058A2-0.11B2-0.068C2

回歸模型方差分析見表3，OD600曲面模型是極顯著的（p=0.0071＜0.01）；溫度對(duì)菌生長影響顯著（p＜0.05），同時(shí)復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.9067，說明因素選擇合理，該模型能夠解釋90.67%的變化。

2.3.2 菌體生長條件的優(yōu)化 利用Design-Expert軟件處理得所得響應(yīng)面分析結(jié)果圖5～圖7。等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，圓形表示兩個(gè)因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩個(gè)因素交互作用顯著。從圖5、圖7可看出，pH和溫度以及溫度和鹽度對(duì)V.a ATCC17749生長的交互作用顯著。利用Design-Expert軟件，3個(gè)因素的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)（A、B、C）代碼值（0.243、0.300、0.221）即（7.62、34.55℃、3.22%），此時(shí)OD600取最大值1.588。

表2 分析方案及結(jié)果Table 2 Experimental results and scheme of response surface method

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with regression model

2.3.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以2.3.3確定的最優(yōu)條件將V.a ATCC17749及海水、貽貝、大黃魚中分離的經(jīng)驗(yàn)證是溶藻弧菌的菌株W1，SH1，F(xiàn)1，F(xiàn)2培養(yǎng)8h，測OD600，做3次平行實(shí)驗(yàn)并取平均值，見表4。其中V.a ATCC17749驗(yàn)證預(yù)測最佳條件實(shí)測值與預(yù)測值偏差為1.70%，證實(shí)響應(yīng)面方法可靠，其他溶藻弧菌菌株與標(biāo)準(zhǔn)菌株有一定的差異性，在此條件雖與預(yù)測值有一定的偏差，但其OD600均達(dá)到了較大的值。

圖5 pH和溫度交互作用對(duì)V.a ATCC17749生長的影響Fig.5 Effect of interaction between the temperature and pH on growth of V.a ATCC17749

圖6 pH和鹽度交互作用對(duì)V.a ATCC17749生長的影響Fig.6 Effect of interaction between the pH and salinity on growth of V.a ATCC17749

圖7 溫度和鹽度交互作用對(duì)V.a ATCC17749生長的影響Fig.7 Effect of interaction between the temperature and salinity on growth of V.a ATCC17749

表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的驗(yàn)證Table 4 Results of demonstration tests

3 結(jié)論與討論

通過單因素分析，溶藻弧菌最適生長條件為pH7.0～8.5，溫度30～37℃，鹽度1～5%。在此基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面的方法綜合考慮pH、溫度和鹽度三個(gè)因素對(duì)菌體生長的影響。根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)了三因素三水平實(shí)驗(yàn)，用Design-Expert軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，V.a ATCC17749的最優(yōu)培養(yǎng)條件為：pH7.62、溫度34.55℃和鹽度3.22%；菌體生長過程中，pH和溫度以及溫度和鹽度對(duì)V.a ATCC17749生長的交互作用顯著。雖然溶藻弧菌不同菌株的最佳生長條件會(huì)有所差異，但是優(yōu)化的V.a ATCC17749生長條件對(duì)其他菌株也有一定參考價(jià)值。

[1]潘曉藝，沈錦玉，尹文林，等.水生動(dòng)物的弧菌病及其致病機(jī)理[J].大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，21（3）：272-277.

[2]Lee K K，Liu P C，Chen Y C，et al.The implication of ambient temperature with the outbreak of vibriosis in cultured small abalone Haliotis diversicolor supertexta Lischke[J].Journal of Thermal Biology，2001，26：585-587.

[3]溫崇慶，薛明，何紅，等.兩株對(duì)蝦幼體弧菌病病原的分離和鑒定[J].微生物學(xué)通報(bào)，2008，35（3）：346-352.

[4]Carlos R，Aliciae E，Juan L B，et a1．Association of Aeromonas hydrophila and Vibrio alginolyticus with Larval Mortalities of Scallop（Argopeeten Purpuratus）[J].Journal of Invertebrate Pathology，1996，67：213-218.

[5]Ardic N，Ozyurt M.Case report：Otitis due to Vibrio alginolyticus[J].Microbiology Bul，2004，38：145-148.

[6]邢素琴，侯穎暉.一起溶藻弧菌一起食物中毒的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)測分析[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2006，22（2）：130-131.

[7]李剛，趙軍.一起由溶藻弧菌引起的食物中毒調(diào)查[J].中國熱帶醫(yī)學(xué)，2008，8（3）：519-520.

Optimization of cultivation conditions of vibrio alginolyticus by response surface methodology

ZHANG Xiao-yan，NING Xi-bin*
（Shanghai Engineering Research Center of Aquatic Product Processing&Preservation，College of Food Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 210306，China）

TS201.2

A

1002-0306（2012）16-0221-04

2011－12－21 *通訊聯(lián)系人

張曉艷（1987-），女，碩士研究生，研究方向：食品安全。

上海市科委工程中心建設(shè)（11DZ2280300）；上海市教育委員會(huì)重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目資助（J50704）。