高健，薛鋒，李鳳偉，徐虹

1(鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城，224051)

2(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院、材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇南京，210009)

利用絮凝及雙水相萃取分離純化發(fā)酵液中的R，R-2，3-丁二醇*

高健1，2，薛鋒1，李鳳偉1，徐虹2

1(鹽城工學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城，224051)

2(南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院、材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇南京，210009)

針對Paenibacillus polymyxa ZJ-9一步法發(fā)酵菊芋菊粉粗提液制備R，R-2，3-丁二醇的發(fā)酵液特點，利用殼聚糖對該發(fā)酵液進(jìn)行絮凝研究。結(jié)果表明，殼聚糖分子量、殼聚糖用量、助凝劑海藻酸鈉用量、pH和攪拌時間分別為:43.5 kDa、0.75 g/L、0.125 g/L、5.0和15 min時，絮凝效果最佳，在此工藝條件下，發(fā)酵液中菌體和蛋白質(zhì)的絮凝率分別高達(dá)89.46%和78.93%，而R，R-2，3-丁二醇保留率約為98.54%。利用雙水相萃取技術(shù)對絮凝后的發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇進(jìn)行了分離，結(jié)果表明，異丙醇/硫酸銨雙水相體系萃取效果最好，當(dāng)異丙醇和硫酸銨的用量分別約為33%和30%(w/w)時，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系數(shù)和萃取率最高，分別約為7.96和89.40%，且異丙醇/硫酸銨雙水相體系能夠有效萃取分離絮凝后的發(fā)酵液中不同含量的R，R-2，3-丁二醇。絮凝和雙水相萃取技術(shù)分離發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇具有針對性強、效率高、成本低等優(yōu)點，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

Paenibacillus polymyxa ZJ-9，R，R-2，3-丁二醇，絮凝，殼聚糖，雙水相萃取

2，3-丁二醇是一種典型的生物基化學(xué)品，是潛在的重要四碳平臺化合物，用途廣泛，可應(yīng)用到食品、燃料、航空航天以及化工等多個領(lǐng)域，用于制備食品添加劑、燃料添加劑、燃料、塑料、炸藥、溶劑、油墨、香水、軟化劑、增濕劑、熏蒸劑、增塑劑等，具有生物降解性[1-2］。R，R-2，3-丁二醇除了具有2，3-丁二醇的用途外，還是優(yōu)良的抗凍劑，合成手性試劑和手性配體的重要中間體，在手性藥物和天然產(chǎn)物的合成中也有潛在的重要應(yīng)用[3-7］。

2，3-丁二醇親水性強、沸點高、黏度大，易于和水發(fā)生共沸現(xiàn)象，分離提純2，3-丁二醇一直成為制約發(fā)酵法生產(chǎn)2，3-丁二醇的瓶頸問題。傳統(tǒng)的2，3-丁二醇分離方法一般是先采用離心法或膜過濾法對發(fā)酵液進(jìn)行預(yù)處理，然后通過有機溶劑萃取、真空膜蒸餾、逆氣流提取、鹽析等技術(shù)進(jìn)一步濃縮提純[8-10］。但是離心法、蒸餾法能耗比較大;膜過濾法、有機溶劑萃取法成本高、污染重。而殼聚糖絮凝和雙水相體系萃取技術(shù)由于具有操作簡單、利于放大、環(huán)境友好、成本低等優(yōu)點逐漸成為分離提純發(fā)酵中2，3-丁二醇的研究熱點[11-13］。作者在前期研究過程中，篩選獲得菌株P(guān)aenibacillus polymyxa ZJ-9能一步法發(fā)酵菊芋菊粉粗提液高產(chǎn)R，R-2，3-丁二醇，且光學(xué)純度達(dá)98%以上[14］。而一步法發(fā)酵菊粉粗提液制備R，R-2，3-丁二醇，發(fā)酵液中除了含有大量菌體、蛋白質(zhì)、未消耗的培養(yǎng)基外，還含有多粘類芽孢桿菌合成的大量粘稠性物質(zhì)以及菊芋菊粉粗提液中殘留的纖維素、果膠等，發(fā)酵液成分非常復(fù)雜，進(jìn)一步增加了分離純化發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇難度。本工作首次嘗試?yán)脷ぞ厶菍Υ祟愺w系進(jìn)行絮凝研究，然后再用親水性有機溶劑/鹽組成的雙水相體系對絮凝后的發(fā)酵液進(jìn)行萃取分離R，R-2，3-丁二醇。

1 材料及方法

1.1 R，R-2，3-丁二醇發(fā)酵液制備

在最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件下，利用菌株P(guān).polymyxa ZJ-9一步法發(fā)酵菊粉粗提液合成R，R-2，3-丁二醇，取42 h的發(fā)酵液(測定R，R-2，3-丁二醇和菊粉的濃度分別約為37.56 g/L和3.83 g/L)用于分離純化研究[14］。

1.2 實驗方法

1.2.1 絮凝劑的配制

選擇脫乙酰度大于90%殼聚糖(分子量約為86.0 kDa)，先用水分散殼聚糖使其終濃度為5%，再加終濃度為5%的HCl溶液水解殼聚糖(每100 mL的5%HCl加1 mL左右的雙氧水)，置回流裝置分別加熱水解15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min，水解后將溶液移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，減壓蒸發(fā)濃縮至粘糊狀，加入無水乙醇后用定性濾紙抽濾，沉淀用研缽研磨，加入乙醇重復(fù)研磨幾遍后，用真空干燥器室溫干燥，結(jié)果為纖維狀或粉末狀的固體。檢測水解后的殼聚糖分子大小，篩選具有最佳絮凝效果的適宜分子量的殼聚糖水解片段。

采用1.0%的醋酸溶液配制殼聚糖水解片段溶液，并用蒸餾水配制助凝劑海藻酸鈉溶液，兩者濃度均為10.0 g/L，磁力攪拌溶解后，靜置溶脹24 h后備用。

1.2.2 發(fā)酵液絮凝單因素實驗

用量筒量取40 mL發(fā)酵液于50 mL小燒杯中，在磁力攪拌下，向發(fā)酵液中逐滴加入適量殼聚糖，然后滴加少量助凝劑海藻酸鈉，攪拌數(shù)分鐘后，靜置，取上清液分析菌體及蛋白的絮凝率。從殼聚糖用量、海藻酸鈉用量、絮凝pH值和攪拌時間4個因素進(jìn)行單因素實驗研究。

1.2.3 發(fā)酵液絮凝正交實驗

根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇殼聚糖用量、海藻酸鈉用量、絮凝pH值和攪拌時間4個因素，按照L9(43)進(jìn)行正交實驗(見表1)，以確定最佳的發(fā)酵液絮凝工藝條件。

表1 絮凝正交實驗因素水平表

1.2.4 雙水相萃取實驗

取5 mL絮凝后的R，R-2，3-丁二醇發(fā)酵液到10 mL的具塞比色管中，分別考察乙醇/磷酸氫二鉀、乙醇/硫酸銨、異丙醇/磷酸氫二鉀、異丙醇/硫酸銨4個雙水相萃取體系對絮凝后的發(fā)酵液中的R，R-2，3-丁二醇分離純化效果。依次加入親水性有機溶劑、鹽，振搖，靜置，然后測定R，R-2，3-丁二醇和殘?zhí)窃陔p水相體系中的分配系數(shù)及萃取率。分配系數(shù)K=Ct/Cb，萃取率Y/%=Mt/M×100，去除率R/%=(1-Mt)/M×100，其中Ct、Cb分別為雙水相萃取時上、下相中的物質(zhì)的濃度;Mt、Mb分別為上相物質(zhì)的量和物質(zhì)的總量。

1.3 分析方法

1.3.1 發(fā)酵液細(xì)胞生物量的測定

將發(fā)酵液稀釋20倍，在660 nm處測定稀釋液的吸光值，并將其轉(zhuǎn)換成細(xì)胞的干重(DCW)。

1.3.2 R，R-2，3-丁二醇的含量測定

發(fā)酵液預(yù)處理:取5 mL發(fā)酵液到離心管，10000 r/min離心10 min，然后取上清液按1∶1體積比加入乙酸乙酯萃取，靜置分層后取上層清液進(jìn)行氣相分析。

檢測條件:毛細(xì)管手性色譜柱Cyclosil-B，30 m×250 μm×0.5 μm;進(jìn)樣口溫度200℃，進(jìn)樣量1.0 μL;分流比20∶1;載氣為高純N2，流速1.2 mL/min;采取程序升溫，初始溫度130℃，最終溫度160℃(維持1 min)，升溫速率5℃/min;FID檢測器，檢測器溫度240℃。

1.3.3 菊粉含量檢測

菊粉含量檢測參照張江紅等方法[11］。

1.3.4 蛋白質(zhì)濃度測定

蛋白質(zhì)濃度測定采用考馬斯亮藍(lán)法[15］。

1.3.5 殼聚糖分子量測定

利用凝膠色譜法測定殼聚糖分子量，以標(biāo)準(zhǔn)分子量的葡聚糖為基準(zhǔn)[16］。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖分子質(zhì)量對R，R-2，3-丁二醇發(fā)酵液絮凝效果的影響

分子質(zhì)量約為86.0 kDa殼聚糖分別經(jīng)HCl加熱水解15 min、30 min、45 min、60 min、75 min和90 min后，測定水解后殼聚糖分子量(kDa)分別約為:72.8、61.2、43.5、28.6、16.9和8.7。分別利用水解后殼聚糖片段及未水解的殼聚糖對R，R-2，3-丁二醇發(fā)酵液中的菌體和蛋白進(jìn)行絮凝。由圖1可知，分子量約為43.5 kDa的殼聚糖對發(fā)酵液中的菌體和蛋白絮凝效果最好。殼聚糖相對分子質(zhì)量越大黏度越大，絮凝效率也會越高，但分子質(zhì)量過大，黏度過高，形成的絮凝顆粒會迅速沉淀，不利于絮凝劑和游離菌體充分作用，反而影響其絮凝效果[16］。但小分子質(zhì)量的殼聚糖對發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)絮凝效果要優(yōu)于對菌體的絮凝，小分子質(zhì)量的殼聚糖形成的膠團(tuán)小，黏度雖低，但相對表面積比較大，能夠充分接觸比菌體形狀小得多的蛋白質(zhì)，易產(chǎn)生絮凝。

圖1 殼聚糖分子質(zhì)量對絮凝效果的影響

2.2 殼聚糖絮凝最佳工藝條件確定

通過單因素實驗對絮凝的工藝條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，殼聚糖用量、助凝劑海藻酸鈉用量、pH和攪拌時間分別為:0.75 g/L、0.125 g/L、5.0和15 min時，絮凝效果相對較好。在上述實驗的基礎(chǔ)上，采用正交實驗確定發(fā)酵液絮凝的最佳工藝條件，實驗結(jié)果見表2。

表2 絮凝正交實驗表及結(jié)果

經(jīng)極差分析處理與方差分析，其結(jié)果分別見表2和表3。由表可知，發(fā)酵液絮凝的影響因素次序為:B﹥A﹥D﹥C，即海藻酸鈉用量(B)對絮凝影響最大，其次是殼聚糖用量，相對其它因素，pH值對絮凝效果影響最小。正交實驗結(jié)果表明，發(fā)酵液絮凝的最佳工藝條件為A2B2C2D3。在最佳絮凝工藝條件下，發(fā)酵液中菌體和蛋白質(zhì)的絮凝率分別達(dá)89.46%和78.93%。最佳條件絮凝后，R，R-2，3-丁二醇濃度約為37.01 g/L，R，R-2，3-丁二醇保留率高達(dá)98.54%。

表3 方差分析表

助凝劑海藻酸鈉能夠吸附在顆粒表面并起架橋作用，溶液中細(xì)小顆粒立即團(tuán)聚成大顆粒沉淀下來，海藻酸鈉用量過多時，使膠團(tuán)過大，導(dǎo)致快速沉淀，反而不利于發(fā)酵液中的游離菌體及蛋白質(zhì)與殼聚糖充分發(fā)生作用，導(dǎo)致絮凝效果偏低。進(jìn)一步加大殼聚糖用量，對發(fā)酵液中的菌體和蛋白質(zhì)的絮凝效果反而降低，可能是因為發(fā)酵液中菌體和蛋白質(zhì)在殼聚糖表面吸附過多，處于吸附過飽和狀態(tài)，使形成的膠團(tuán)重新出現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)，難以絮凝沉淀。攪拌時間過短，絮凝劑不能夠和菌體及蛋白質(zhì)充分接觸，導(dǎo)致絮凝不充分;而攪拌時間過長，容易攪碎絮凝形成的膠團(tuán)，溶液體系再次趨于穩(wěn)定，難以發(fā)生絮凝沉淀，絮凝效果反而不佳。一般情況下，酸性條件有利于殼聚糖對發(fā)酵液中的菌體和蛋白質(zhì)進(jìn)行絮凝，殼聚糖在酸性條件下發(fā)生質(zhì)子化，呈現(xiàn)陽離子絮凝劑的特征，質(zhì)子化位點提供架橋的端點，并通過助凝劑的架橋作用促進(jìn)絮凝發(fā)生。過酸的條件易使殼聚糖發(fā)生水解，反而不利于架橋作用，阻礙殼聚糖對菌體的絮凝。但是，pH越小越有利于去除蛋白質(zhì)，這可能是因為溶液過酸容易使蛋白質(zhì)發(fā)生變性作用。

2.3 雙水相萃取體系的選擇

選擇乙醇/硫酸銨、乙醇/磷酸氫二鉀、異丙醇/硫酸銨、異丙醇/磷酸氫二鉀4個雙水相體系為考察對象，取絮凝后的上清液5 mL到具塞比色管中，分別加入2 mL醇后再分別添加濃度(w/w)為15%、20%、25%、30%和35%的鹽，充分振搖后靜置12 h。結(jié)果表明，在鹽濃度梯度范圍內(nèi)，乙醇/硫酸銨體系均難以分相;當(dāng)鹽濃度為15%和20%時，乙醇/磷酸氫二鉀和異丙醇/磷酸氫二鉀體系也不分相，而鹽濃度達(dá)25%和30%時，上述兩種體系上相體積遠(yuǎn)大于加入的醇的體積，分相效果欠佳;在鹽濃度梯度范圍內(nèi)，異丙醇/硫酸銨體系分相效果良好，上相體積與加入的異丙醇體積相當(dāng)。分析原因，可能是乙醇水化能力比異丙醇強，水分子留在乙醇相中較多，對體系分相不利。王志華等[17］也曾進(jìn)行過這方面相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)對于雙水相萃取，異丙醇比乙醇效果好，與本文研究結(jié)論較一致。由于硫酸銨比磷酸氫二鉀更利于體系分相，且價格低廉，因此從考察的4個體系中選定異丙醇/硫酸銨雙水相體系對絮凝后發(fā)酵液中的R，R-2，3-丁二醇進(jìn)行分離純化。

2.4 雙水相體系對絮凝后發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇的分離效果

利用異丙醇/硫酸銨雙水相體系對絮凝后的發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇進(jìn)行分離純化，雙水相體系中的異丙醇和硫酸銨的濃度(w/w)能夠顯著地影響R，R-2，3-丁二醇分離效果，結(jié)果如圖2和圖3。

圖2 異丙醇和硫酸銨濃度對R，R-2，3-丁二醇分配系數(shù)(k)的影響

圖3 異丙醇和硫酸銨濃度對R，R-2，3-丁二醇萃取率(Y)的影響

由圖2和圖3可知，隨著異丙醇濃度的提高，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系數(shù)和萃取率逐步增加，但異丙醇的濃度從24%向36%的變化過程中，分配系數(shù)和萃取率上升趨勢趨于平緩，到33%時萃取率幾乎不再改變，而硫酸銨濃度變化對R，R-2，3-丁二醇分離效果的影響，30%濃度明顯優(yōu)于35%及40%濃度。因此，當(dāng)異丙醇和和硫酸銨的濃度分別為33%和30%時，雙水相萃取體系對絮凝后發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇的分離效果最佳，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系數(shù)和萃取率分別達(dá)7.96和89.40%。上述結(jié)果表明，絕大部分R，R-2，3-丁二醇存在于上相異丙醇中。雖然R，R-2，3-丁二醇具有很強的親水性，但在異丙醇/硫酸銨雙水相體系中，由于鹽析作用，導(dǎo)致大多數(shù)R，R-2，3-丁二醇分配到上相異丙醇中，隨著異丙醇濃度的增加，鹽析作用不斷增強，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系數(shù)和萃取率也逐步提高[13］。

異丙醇/硫酸銨雙水相體系對絮凝后的發(fā)酵液中的菊粉幾乎不產(chǎn)生萃取作用，結(jié)果如圖4所示。由圖4可以看出，伴隨異丙醇和硫酸銨濃度的增加，絮凝后的發(fā)酵液中菊粉在上相的分配系數(shù)進(jìn)一步降低，當(dāng)異丙醇和硫酸銨的質(zhì)量濃度分別為33%和30%時，菊粉在上相的分配系數(shù)僅為0.038，絕大部分菊粉分配在下相水中，R，R-2，3-丁二醇與菊粉在異丙醇/硫酸銨雙水相體系中選擇性分離系數(shù)高達(dá)209.47，該結(jié)果表明絮凝后的發(fā)酵液中發(fā)酵產(chǎn)物R，R-2，3-丁二醇和發(fā)酵液中殘留的底物菊粉通過異丙醇/硫酸銨雙水相萃取能夠達(dá)到高效分離的效果。

圖4 異丙醇和硫酸銨濃度對菊粉分離的影響

2.5 絮凝后發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇含量對分離效果的影響

菌株P(guān).polymyxa ZJ-9一步法發(fā)酵菊粉粗提液合成R，R-2，3-丁二醇，不同發(fā)酵批次，產(chǎn)物R，R-2，3-丁二醇的產(chǎn)量經(jīng)常發(fā)生變化，特別是補料發(fā)酵，產(chǎn)量差異尤為明顯。利用異丙醇/硫酸銨雙水相體系對絮凝后的發(fā)酵液中不同含量的R，R-2，3-丁二醇進(jìn)行了萃取分離，由表4可以看出，隨著發(fā)酵液中的R，R-2，3-丁二醇含量的提高，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系數(shù)和萃取率也逐步增加，萃取分離效果越來越好，因此，異丙醇/硫酸銨雙水相體系非常適合分離純化絮凝后的發(fā)酵液中不同含量的R，R-2，3-丁二醇。在進(jìn)行雙水相萃取時，有趣的是，在上下相之間常形成一個“中間相”，其主要成分是可溶性蛋白質(zhì)和菌體，由于在雙水相體系混合過程中蛋白質(zhì)發(fā)生了不可逆轉(zhuǎn)的變性作用，導(dǎo)致了變性蛋白存在于上、下相之間[18］。由表4可知，異丙醇/硫酸銨雙水相體系能夠有效地對絮凝后發(fā)酵液中殘留的菌體、可溶性蛋白質(zhì)及其它雜質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步去除，大幅度地提高了對發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇分離純化效果。

發(fā)酵液中2，3-丁二醇的傳統(tǒng)分離方法主用包含2個過程，先用膜過濾法或離心法去除殘留的菌體、蛋白和一些雜質(zhì)，再用蒸餾法獲得2，3-丁二醇[13］，這些方法導(dǎo)致分離純化丁二醇成本高、效果差。而利用異丙醇/硫酸銨雙水相體系對絮凝后發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇進(jìn)行萃取分離明顯優(yōu)于上述分離效果，菊粉主用存在于下相水中可重復(fù)利用，殘留菌體和蛋白主用凝聚在“中間相”中容易去除，產(chǎn)物R，R-2，3-丁二醇主要分配在上相異丙醇中，很方便地通過蒸餾進(jìn)行進(jìn)一步分離純化(異丙醇沸點僅為82.5℃)，并且上相中幾乎不含菌體和蛋白質(zhì)量，有效地避免了蒸餾過程中經(jīng)常發(fā)生的粘漿現(xiàn)象[13］。利用雙水相萃取分離R，R-2，3-丁二醇，具有效率高、成本低等優(yōu)點，適用于工業(yè)化分離制備R，R-2，3-丁二醇。

表4 發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇含量對分離效果的影響

3 結(jié)論

利用殼聚糖對P.polymyxa ZJ-9一步法發(fā)酵菊粉粗提液制備R，R-2，3-丁二醇的發(fā)酵液進(jìn)行絮凝，研究發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量為43.5 kDa的殼聚糖對發(fā)酵液中的菌體和蛋白絮凝效果最好，并通過單因素實驗和正交實驗對絮凝的最佳工藝條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，殼聚糖用量0.75 g/L、助凝劑海藻酸鈉用量0.125 g/L、pH 5.0和攪拌時間15 min時，絮凝效果最佳，且海藻酸鈉用量對絮凝影響最大，其次是殼聚糖用量，相對其它因素，pH對絮凝效果影響最小。在最佳絮凝工藝條件下，發(fā)酵液中菌體和蛋白質(zhì)的絮凝率分別高達(dá)89.46%和78.93%，而R，R-2，3-丁二醇保留率約為98.54%。利用雙水相萃取技術(shù)對絮凝后的發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇進(jìn)行了分離，結(jié)果表明異丙醇/硫酸銨雙水相體系萃取效果最好，當(dāng)異丙醇和硫酸銨的用量分別約為33%和30%(w/w)時，R，R-2，3-丁二醇在上相的分配系數(shù)和萃取率最高，分別為7.96和89.40%，并且異丙醇/硫酸銨雙水相體系能夠有效萃取分離絮凝后的發(fā)酵液中不同含量的R，R-2，3-丁二醇。絮凝和雙水相萃取分離純化發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇具有效率高、成本低等優(yōu)點，對發(fā)酵液中R，R-2，3-丁二醇大規(guī)模分離提取應(yīng)用提供了可靠的技術(shù)基礎(chǔ)。

[1]Tran A V，Chambers R P.The dehydration of fermentative 2，3-butanediol into methyl ethyl ketone[J］.Biotechnol Bioeng，1987，29(3):343-351.

[2]Ng T K，Busche R M，McDonald C C，et al.Production of feedstock chemicals[J］.Science，1983，219(4585):733-740.

[3]Celińska E，Grajek W.Biotechnological production of 2，3-butanediol-Current state and prospects[J］.Biotechnology Advances，2009，27(6):715-725.

[4]Mas C D，Jansen N B.Tsao G T.Production of optically active 2，3-butanediol by Bacillus polymyxa[J］.Biotechnol Bioeng，1988，31:366-377.

[5]Ceskis B，Lebedavia K V，Moiseankov A M.Eflective synthesis of the(4R，8R)-and(4R，8S)-diastereomers of 4，8-dimethyldecanal，Aggregation pheromones of the brionid beetles tribolium confusm and tribolium cast aneum[J］.Izv Akad Nauk SSSR Ser Khim，1988(4):865.

[6］羅云富，李援朝.手性鄰二醇——(2S，3R)21，2，32丁三醇212對甲苯磺酸酯的不對稱合成[J］.有機化學(xué)，2002，22(4):262-264.

[7]Shigeki I，T akehiro T，Hiroyuki I，et al.Color-compensating plate for surpert wisted-nematic liquid-crystal display device[J］.Jpn Kokai T okkyo Koho，1991，91:623.

[8]Qureshi N，MeagherM M，Hutkins R W.Recovery of 2，3-butanediol by Vacuum Membrane Distillation[J］.Separation Science and Technology，1994，29(13):733-1748.

[9]Anvari M，Khayati G.Insitu recovery of 2，3-butanediol from fermentation by liquid-liquid extraction[J］.Ind Microbiol Biotechnol，2009，36(2):313-317.

[10］江波，張江紅，李志剛，等.2，3-丁二醇的發(fā)酵及鹽析分離工藝[J］.生物加工過程，2009，7(1):44-48.

[11]張江紅，孫麗慧，修志龍.2，3-丁二醇發(fā)酵液的絮凝除菌與絮凝細(xì)胞的循環(huán)利用[J］.過程工程學(xué)報，2008，8(4):779-783.

[12]Sun L H，Jiang B，Xiu Z L.Aqueous two-phase extraction of 2，3-butanediol from fermentation broths by isopropanol/ammonium sulfate system[J］.Biotechnol Lett，2009，31(3):371-376.

[13]Jiang B，Li Z G，Dai J Y.Aqueous two-phase extraction of 2，3-butanediol from fermentation broths using an ethanol/phosphate system[J］.Process Biochemistry，2009，44(1):112-117.

[14]Gao J，Xu H，Li Q J，et al.Optimization of medium for one-step fermentation of inulin extract from Jerusalem Artichoke Tubers using Paenibacillus polymyxa ZJ-9 to Produce R，R-2，3-butanediol[J］.Bioresource Technology，2010，101:7076-7082.

[15]Bradford M M A.Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J］.Analytical Biochemistry，1976，72(1):248-251.

[16］蔣挺大.甲殼素[M］.北京:中國環(huán)境科學(xué)出版社，1996:99-109.

[17]王志華，馬會民，馬泉莉，等.雙水相萃取體系的研究[J］.應(yīng)用化學(xué)，2001，18(3):173-175.

[18]Louwrier A.Model phase separations of proteins using aqueous/ethanol components[J］.Biotechnol Tech，1998，12(5):363-365.

ABSTRACTR，R-2，3-Butanediol(R，R-2，3-BD)can been produced through one-step fermentation of inulin extract from Jerusalem artichoke tubers using Paenibacillus polymyxa ZJ-9.The pretreatment of fermentation broth by chitosan flocculation was investigated.The results were as following:the optimum flocculation was obtained using 0.75 g/L of chitosan with 43.5 ku molecular weight，0.125 g/L of sodium alginate，pH 5.0 and stirring for 15 minutes.The flocculation rate of cells and proteins reached 89.46%and 78.93%，respectively，and the retained ratio of R，R-2，3-butanediol reached 98.54%.Then，the different aqueous two-phase extraction systems were used to further investigate extraction of R，R-2，3-BD from the pretreated fermentation broth and the isopropanol/ammonium sulphate system was chosen as optimum system.The optimum phase composition was 33%(w/w)of isopropanol and 30.0%(w/w)of ammonium sulphate，and the partition coefficient and recovery of R，R-2，3-BD reached 7.96 and 89.40%，respectively.Furthermore，the isopropanol/ammonium sulphate aqueous two-phase extraction system could be used to separate different concentration R，R-2，3-BD from the pretreated fermentation broth by chitosan flocculation.

Key wordsPaenibacillus polymyxa，2，3-butanediol，flocculation，chitosan，aqueous two-phase extraction

Flocculation and Aqueous Two-phase Extraction of R，R-2，3-Butanediol from Fermentation Broth

Gao Jian1，2，Xue Feng1，Li Feng-wei1，Xu Hong2
1(School of Chemical and Biological Engineering，Yancheng Institute of Technology，Yancheng 224051，China)
2(State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，College of Food Science and Light Industry，Nanjing University of Technology，Nanjing 210009，China)

博士(徐虹博導(dǎo)為通訊作者)。

*江蘇省自然科學(xué)基金計劃項目(BK2010290);江蘇省教育廳高?？蒲谐晒a(chǎn)業(yè)化推進(jìn)項目(JHB2011-54);鹽城工學(xué)院科研基金項目(XKY2009006)。

2012-03-16，改回日期:2012-05-06