李 寧 周煥玉 張媛媛 周 巖 徐 放

河北大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，河北保定 071000

內(nèi)毒素血癥是造成膿毒癥的一個(gè)重要原因，血液中的內(nèi)毒素（lipopolysaccharides，LPS）促使補(bǔ)體活化和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等多種促炎介質(zhì)釋放，后者導(dǎo)致嚴(yán)重的外周血管阻力降低，低血壓和微循環(huán)障礙最終發(fā)展為組織缺血缺氧、休克和多器官功能衰竭[1]。筆者前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用聚偏氟乙烯-絲氨酸（PVDF-Ser）進(jìn)行血液灌流，可有效清除膿毒癥豬的血漿LPS，降低TNF-α和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6），最終降低72 h死亡率[2]。本研究旨在進(jìn)一步證實(shí)其對(duì)感染性休克的血流動(dòng)力學(xué)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 大長(zhǎng)種家豬16只，雄性，體重（22.3±3.5）kg，由河北大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表分為兩組：PVDF-Ser組（E 組）8 只，LPS 給藥完成后 1 h，應(yīng)用PVDF-Ser吸附膜進(jìn)行血液灌流2 h，血流速50 mL/min；對(duì)照組（C組）8只，應(yīng)用空白灌流器（容積與PVDF-Ser相同）進(jìn)行血液灌流2 h。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 內(nèi)毒素 （LPS from Escherichia coli 0111:B4，L2630）由SIGMA公司提供，鱟試劑由福建省廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠提供，檢測(cè) IL-1β、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和高遷移率組蛋白-1（high-mobility group box-1 protein，HMGB-1）的 ELISA試劑盒由Bluegene公司提供。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)備 蠕動(dòng)泵由河北省保定市蘭格恒流泵有限公司提供（型號(hào)BT01-100），Servo300 型呼吸機(jī)由瑞典SIMENS公司提供，PiCCO由德國(guó)PULSION公司提供。

1.1.4 PVDF-Ser吸附膜 由浙江大學(xué)工學(xué)院合成提供（專利號(hào)200910100567.5），容積80 mL，有效吸附面積為4 830 cm2。

1.2 實(shí)驗(yàn)步驟

1.2.1 麻醉：首先給予氯胺酮5mg/kg+咪達(dá)唑侖0.5mg/kg肌肉注射，然后咪達(dá)唑侖 6 mg/（kg·h）+芬太尼 60 μg/（kg·h）靜脈泵入維持。

1.2.2 所有動(dòng)物均行經(jīng)口氣管插管，機(jī)械通氣[容量控制模式：潮氣量6 mL/kg，頻率25次/min，吸入氧濃度 100%，呼氣末正壓 0 cm H2O（1 cm H2O=0.098 kPa）]。

1.2.3 兩側(cè)頸外靜脈穿刺置管用于血液灌流；右側(cè)頸內(nèi)靜脈置入單腔深靜脈導(dǎo)管，連接溫度感知探頭；左側(cè)股動(dòng)脈置入PiCCO動(dòng)脈溫度壓力導(dǎo)管；左側(cè)股靜脈置入雙腔深靜脈導(dǎo)管，用于注射LPS、輸注液體和采集血樣。

1.2.4 復(fù)制內(nèi)毒素致感染性休克模型：LPS持續(xù)靜脈泵入4 h，劑量 1 μg/（kg·h）[3]。 開始注射 LPS 后，輸注 0.9%的氯化鈉溶液 30 mL/（kg·h）。

1.3 血液標(biāo)本采集、保存和檢測(cè)

分別于注射LPS前和完成注射后即刻、1、2、3、4 h采集血樣，依次記為T0～T5。標(biāo)本立即在4℃的條件下離心3 000 g×10 min， 取血漿在-80℃條件保存。 測(cè)定 LPS、IL-1β、IL-8、IL-10 和 HMGB-1。

1.4 血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的采集

分別于T0～T5測(cè)定有創(chuàng)平均動(dòng)脈壓 （mean arterial pressure，MAP）、中心靜脈壓（central venous pressure，CVP）、每搏輸出量指數(shù)（stroke volume index，SVI）、心排指數(shù)（cardiac index，CI）、體循環(huán)阻力指數(shù)（systemic vascular resistance index，SVRI）和全心舒張末期容量指數(shù) （global enddiastolic volume index，GEDVI）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間基線數(shù)據(jù)的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中LPS、細(xì)胞因子和血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)毒素及細(xì)胞因子水平

組間基線數(shù)據(jù)比較均無(wú)差異（P＞0.05）。注射LPS后，內(nèi)毒素均明顯升高，組間比較無(wú)差異（P=0.089）；此后，內(nèi)毒素水平均呈下降趨勢(shì)，但開始血液灌流后E組顯著低于C組。IL-1β、IL-8、IL-10 和HMGB-1 在注射LPS后均顯著增高，C組的升高趨勢(shì)持續(xù)到LPS注射結(jié)束后2 h，此后變?yōu)榫徛陆?；而E組在開始血液灌流后即明顯降低，顯著低于C組，IL-10 在結(jié)束灌流后1 h已接近實(shí)驗(yàn)前水平（P=0.132）。見表1。

2.2 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)

兩組基線數(shù)據(jù)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給予LPS 后，兩組動(dòng)物出現(xiàn) MAP、CVP、SVI、SVRI和 GEDVI下降，CI則先升高后降低，符合感染性休克的典型改變。與C組相比，E 組行血液灌流后，MAP、SVI、CI、SVRI和 GEDVI均有顯著改善，這種效應(yīng)持續(xù)到灌流結(jié)束后1 h。而CVP僅在血液灌流 2 h 后略有升高[（3±1） mm Hg vs （2±1） mm Hg，P=0.017]（1mmHg=0.133kPa）。與灌流前比較，E組中除CI在灌流2 h后回升、CVP無(wú)改善外，其他參數(shù)均在開始灌流1 h后即呈升高表現(xiàn)；而C組的多項(xiàng)指標(biāo)呈進(jìn)行性惡化趨勢(shì)。見表2。

3 討論

LPS作為革蘭陰性細(xì)菌的外層細(xì)胞壁的重要組成部分，當(dāng)菌體繁殖或死亡后，其以游離形式或與菌體表層蛋白結(jié)合的形式釋放。與血漿LPS結(jié)合蛋白 （LPS-binding protein，LBP）形成復(fù)合物，到達(dá)粒單核細(xì)胞膜CD14分子（membrane CD14，mCD14）或與可溶性 CD14 分子（soluble CD14，sCD14）結(jié)合，sCD14/LPS復(fù)合物則進(jìn)一步結(jié)合到CD14-的血管內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞。在跨膜蛋白Toll-like receptor家族(TLR)，尤其是TLR4的作用下，依次募集調(diào)節(jié)分子MyD88 和IL-1 受體相關(guān)激酶實(shí)現(xiàn)LPS信號(hào)從mCD14 到胞質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。然后通過(guò)核因子κB途徑或氨基末端激酶/應(yīng)激活化蛋白激酶途徑造成細(xì)胞活化，大量炎癥基因表達(dá)，多種促炎和抗炎因子合成釋放，從而導(dǎo)致嚴(yán)重而失控的全身性炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步發(fā)展為感染性休克、多器官功能障礙綜合征[4-5]。正是基于內(nèi)毒素作為膿毒癥、感染性休克發(fā)生進(jìn)展的始動(dòng)和關(guān)鍵環(huán)節(jié)的認(rèn)識(shí)，近年來(lái)大量研究證實(shí)，應(yīng)用多黏菌素B等多種內(nèi)毒素吸附劑進(jìn)行血液灌流，可以有效清除血漿內(nèi)毒素，控制炎癥介質(zhì)水平，從而改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂和組織灌注，減輕氧化應(yīng)激和呼吸氧合異常，最終降低膿毒癥病死率[6-8]。筆者前期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)應(yīng)用PVDF-Ser進(jìn)行血液灌流，可以有效吸附膿毒癥豬的血漿LPS，進(jìn)而降低TNF-α和IL-6 水平，減輕肺、肝、腸等器官損傷，最終降低實(shí)驗(yàn)組死亡率[2]。

血漿吸附、血液濾過(guò)等多種血液凈化措施用于治療膿毒癥和MODS的機(jī)制研究不斷深入，其中“峰值濃度學(xué)說(shuō)”認(rèn)為發(fā)生膿毒癥時(shí)機(jī)體免疫反應(yīng)處于完全混亂的狀態(tài)，促炎和抗炎介質(zhì)的峰值濃度可同時(shí)或先后出現(xiàn)，血液凈化是非選擇性清除這兩類炎癥介質(zhì)，降低促炎介質(zhì)的峰值濃度，減少其對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞和血流動(dòng)力學(xué)的影響；降低抗炎介質(zhì)的峰值濃度，保持了細(xì)胞對(duì)內(nèi)毒素血癥反應(yīng)性，恢復(fù)了機(jī)體的免疫能力[9]。Shimizu等[6]和Takwmi等[10]的臨床研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)了如上觀點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PVDF-Ser吸附膜在清除血漿LPS的基礎(chǔ)上，不僅有效控制IL-1β、IL-8的異常升高，亦可降低抗炎因子IL-10的血漿水平，從而重建機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)，提高 MAP、SVI、SVRI和 GEDVI，進(jìn)一步驗(yàn)證了以上假說(shuō)和解釋了PVDF-Ser改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂的機(jī)制。

表1 血漿內(nèi)毒素和細(xì)胞因子變化（±s）

表1 血漿內(nèi)毒素和細(xì)胞因子變化（±s）

注：與組內(nèi)T0 比較，aP＜0.05；與C組相同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05，cP＜0.01

指標(biāo) T0（給予LPS前）T1T2T3T4T5（注射LPS后） （開始HP前） （HP 1 h后） （HP 2 h后） （結(jié)束HP 1 h后）LPS（EU/mL）C組E組IL-1β（pg/mL）C組E組IL-8（pg/mL）C組E組IL-10（pg/mL）C組E組HMGB-1（ng/mL）C組E組0.029±0.011 0.033±0.0150.476±0.150a 0.511±0.207a 0.403±0.083a 0.395±0.121a 0.349±0.104a 0.135±0.081ab 0.274±0.032a 0.079±0.053ac 0.247±0.091a 0.050±0.034b 47±8 42±10 522±157a 480±94a 671±103a 609±65a 769±224a 289±141ac 590±291a 202±30ab 514±109a 149±55ab 79±3547±40 1 004±337a 753±228a 2 336±748a 1 966±450a 3 085±534a 909±264ac 2 477±837a 580±95ab 1911±490a 304±125ab 183±58 224±30 1 440±219a 1 335±162a 1 992±541a 2 110±614a 2 277±451a 1 105±303ab 1 773±307a 623±179ab 1 557±489a 377±135b 21±12 17±1539±11 45±26a 55±32a 67±16a 80±28a 49±31ab 77±40a 34±22b 65±17a 29±19ab

表2 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化（±s）

表2 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化（±s）

注：與組內(nèi)T0 比較，aP＜0.05；與C組相同時(shí)間點(diǎn)比較，bP＜0.05，cP＜0.01

參數(shù) T0（給予LPS前）T1T2Ta Ta T5（注射LPS后） （開始HP前） （HP 1 h后） （HP 2 h后） （結(jié)束HP 1 h后）MAP（mm Hg）C組E組CVP（mm Hg）C組E組SVI（mL/m2 ）C組E組CI[L/（min·m2 ）]C組E組SVRI[dyn·s/（cm5 ·m2 ）]C組E組GEDVI（mL/m2 ）C組E組97±1590±11 73±20a 81±14a 63±16a 60±12a 51±10a 74±14ab 44±9a 83±21ac 47±11a 80±16ab 7±4 6±54±3a 3±1a 2±3a 2±2a 2±2a 2±3a 2±1a 3±1ab 2±2a 3±2a 38.3±3.60 34.9±2.40 22.3±2.70a 24.5±1.40a 18.1±3.80a 20.3±4.40a 15.3±2.10a 23.8±5.60ac 13.2±1.90a 29.2±4.00ab 14.6±3.00a 27.0±2.50ac 4.25±0.77 4.10±1.03 5.01±0.59a 4.81±0.34a 3.59±0.72a 3.66±0.43 3.18±0.95aa 3.54±0.50ab 2.90±0.26a 3.81±0.78ab 2.61±0.67a 3.74±0.13ab 1 426±370 1 291±205956±174a 868±239a 703±272a 727±155a 652±177a 804±210ab 603±84a 1 027±142ab 645±106a 1 003±399ab 558±93 503±47 375±114a 324±80a 329±68a 285±91a 266±64a 333±72a 283±40a 401±101ab 232±57a 445±69ab

現(xiàn)已證實(shí)，HMGB-1 在內(nèi)毒素血癥和嚴(yán)重膿毒癥的病生理過(guò)程中扮演晚發(fā)炎癥介質(zhì)的重要角色，大量釋放可激活炎癥反應(yīng)、活化單核細(xì)胞和誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的黏附分子[11]。Yuichiro等[12]對(duì)20例感染性休克患者應(yīng)用多黏菌素B進(jìn)行血液灌流，發(fā)現(xiàn)與死亡組相比，存活組的HMGB-1 顯著改善，提示可能通過(guò)降低HMGB-1的途徑，糾正感染性休克的循環(huán)衰竭。筆者的研究顯示，血液灌流2 h后，E組HMGB-1 較灌流前顯著降低[（34±22）ng/mL vs（67±16）ng/mL，P=0.007]，同時(shí)也明顯低于 C 組水平 [（34±22）ng/mL vs （77±40）ng/mL，P=0.024]。表明PVDF-Ser可能通過(guò)清除血漿HMGB-1 控制炎癥反應(yīng)和改善血流動(dòng)力學(xué)紊亂。

近來(lái)，大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究報(bào)道了多種內(nèi)毒素和炎癥介質(zhì)吸附治療在膿毒癥、感染性休克和MODS中的積極影響，提示未來(lái)它可能成為膿毒癥的重要治療手段[13]。筆者的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了PVDF-Ser通過(guò)清除HMGB-1 和非選擇性清除促炎、抗炎介質(zhì)的機(jī)制，在調(diào)節(jié)失控的嚴(yán)重炎癥反應(yīng)和糾正血流動(dòng)力學(xué)紊亂方面的有效作用，不失為膿毒癥和感染性休克血液灌流的有益嘗試。

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