毛張凡 徐小惠 黃 杰 耿 慶

1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院胸外科，湖北武漢 430060；2.華中科技大學(xué)同濟醫(yī)院藥劑科，湖北武漢 430030

槲皮素是黃酮類化合物的一種，有廣泛的藥理學(xué)作用，如抗氧化、抗高血壓、抗缺血再灌注損傷、抗腫瘤等[1-2]。但天然的黃酮類化合物不易于提取、制備和保存，加之其生物利用度低，半衰期短，效價低，均妨礙了其研發(fā)和利用。這些特點是由于其含有多個羥基。而用多甲基替代多羥基結(jié)構(gòu)會使黃酮類化合物具有明顯的藥代動力學(xué)特點和藥效動力學(xué)優(yōu)勢。但目前天然多甲氧基黃酮由于提取工困難，其使得量少、價格貴，研究僅限于細胞水平而難以進行體內(nèi)藥理學(xué)研究。五甲基槲皮素（Pentamethylquercetin，PMQ）是對槲皮素進行了甲基化改造而獲得。由于工藝的改進，獲得了高純度、低價位的PMQ，得以體內(nèi)研究PMQ的藥理學(xué)特性。

筆者之前的研究發(fā)現(xiàn)PMQ除有較強的抗氧化作用外，還有對抗心肌肥厚、纖維化及靜脈內(nèi)膜增生的作用[3-4]，但考慮到臨床上兩者多相伴隨，如接受冠狀動脈旁路移植術(shù)（CABG）或支架植入術(shù)（PTCA）的冠心病患者多伴有慢性充血性心力衰竭和心肌重構(gòu)，這些患者術(shù)后仍將面臨心肌肥厚、纖維化、心力衰竭和靜脈橋管再狹窄的問題，故本研究嘗試探索PMQ對這類患者是否有益。本實驗通過制作大鼠頸部靜脈移植模型并用血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導(dǎo)心肌重構(gòu)模擬接受搭橋術(shù)的冠心病患者的體內(nèi)情況，通過口服PMQ干預(yù)，研究其是否有治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康雄性SD大鼠30只（體重250～300 g，同濟醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)部），正常喂養(yǎng)。所有大鼠均建立頸部自體靜脈移植模型，并均于第15 天開始皮下注射AngⅡ [288 μg/（kg·d），分 5次頸項部皮下緩慢注射][5]，于 21 d 后取材。

1.2 模型建立

所有手術(shù)均由同一人操作完成，所用顯微鏡是Carl Zeiss單人雙目手術(shù)顯微鏡（德國蔡司光學(xué)儀器公司），所用顯微外科手術(shù)器械購自上海手術(shù)機械廠。

10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3 mL/kg）后，1%肝素1 mL/kg腹腔注射肝素化。頸部備皮，縱行切口，無損傷游離頸外靜脈，用9-0 無損傷Polypropylene縫線（上海醫(yī)用縫合針廠）行頸外靜脈與頸總動脈的端端間斷吻合。如靜脈移植血管充盈、紅潤、隨動脈一起搏動良好，則說明血管通暢，將血管復(fù)位，消毒后關(guān)閉切口。

1.3 分組及取材

動物被平均隨機分為三組：模型組、溶劑組、治療組。分別每晨給予生理鹽水（5mL/kg）、溶劑[二甲亞砜（DMSO）和5%聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 溶劑按1∶9 配制，5mL/kg]和25mg/kg PMQ灌胃（DMSO為溶劑配制5%PMQ母液，每次給藥前按PMQ母液和5%PVP溶液1∶9 比例制成0.5%的PMQ黃白色乳劑，按5mL/kg即25mg/kg灌胃）。于第22 天麻醉后于原頸部切口處剪開皮膚，游離移植靜脈及兩端足夠長的頸動脈。迅速開胸，取出心臟稱重。將移植靜脈及左室中段于4%多聚甲醛中固定，其余心肌組織液氮凍存待測。石蠟包埋，連續(xù)切片（厚5μm），取3 張切片行HE染色。

1.4 心肌肥厚指標(biāo)測定

剪除心房和大動脈，吸干，用分析天平稱量心臟（HW）及左心室（LW）重量，除以體質(zhì)量（BW），得心臟指數(shù)（HW/BW）及左心指數(shù)（LW/BW）。

1.5 心肌纖維化指標(biāo)測定

羥脯氨酸含量用氯胺T法檢測（南京建成公司）。膠原容積分?jǐn)?shù)（CVF）Ⅰ/Ⅲ用免疫組化染色后用圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro Plus 5.0）測定。每張切片隨機選6個視野（不含血管周圍膠原），計算每個視野Ⅰ、Ⅲ型膠原陽性部分占視野面積百分比，取其均數(shù)即為CVF。

1.6 新生內(nèi)膜增生測定

每張切片隨機4個點，用圖像分析系統(tǒng)（Image-Pro Plus 5.0）測量內(nèi)膜（I）與中膜（M）的厚度、面積比。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 13.0 對實驗數(shù)據(jù)進行分析，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析及Tukey HSD，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組左心指數(shù)和心臟指數(shù)比較

LVW/BW和HW/BW是反應(yīng)心肌肥厚程度的指標(biāo)。結(jié)果顯示溶劑組和模型組LVW/BW和HW/BW差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。而治療組的LVW/BW和HW/BW明顯低于以另外兩組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05 或P<0.01）。見表1。

2.2 各組羥脯氨酸含量和CVFⅠ/Ⅲ比較

羥脯氨酸的含量可反映心肌總體纖維化的程度，CVFⅠ/Ⅲ反應(yīng)心室順應(yīng)性。治療組的心肌羥脯氨酸含量和CVFⅠ/Ⅲ顯著低于模型組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01），從而抑制心肌纖維化，而溶劑組與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。 見表2。

表1 各組左心指數(shù)和心臟指數(shù)比較結(jié)果（±s，mg/g）

表1 各組左心指數(shù)和心臟指數(shù)比較結(jié)果（±s，mg/g）

注：與治療組比較，#P<0.05，##P<0.01

組別 HW/BW LVW/BW模型組（n=10）溶劑組（n=10）治療組（n=10）2.87±0.23##2.93±0.39##2.55±0.38 2.29±0.24#2.38±0.17#1.98±0.20

表2 各組羥脯氨酸含量及CVFⅠ/Ⅲ（±s）

表2 各組羥脯氨酸含量及CVFⅠ/Ⅲ（±s）

注：與模型組比較，##P<0.01

組別 羥脯氨酸含量（μg/g） CVFⅠ/Ⅲ模型組（n=10）溶劑組（n=10）治療組（n=10）503.5±31.4 498.3±25.8 422.1±31.8##4.7±0.8 4.6±0.6 3.4±0.6##

2.3 各組I/M厚度比及面積比

HE染色可見，模型組的新生內(nèi)膜明顯增生，而治療組的I/M厚度比和面積比均明顯小于模型組和溶劑組，差異均有高度統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。見表3。

表3 各組I/M厚度比及面積比（±s）

表3 各組I/M厚度比及面積比（±s）

注：與治療組比較，##P<0.01

組別 I/M厚度比 I/M面積比模型組（n=10）溶劑組（n=10）治療組（n=10）1.51±0.35##1.57±0.17##0.89±0.18 1.83±0.33##1.79±0.28##1.15±0.14

3 討論

冠心病患者往往同時患有多種疾病，需服用多種藥物。接受CABG或PTCA的患者，其遠期效果取決于血管新生內(nèi)膜增生的程度。如大隱靜脈是搭橋手術(shù)最常用的靜脈橋管，由于移植靜脈新生內(nèi)膜的增生，其10年閉塞率超過50%。雖然隨著手術(shù)技術(shù)的改進，其通暢率較前好轉(zhuǎn)，但內(nèi)膜的增生并不能通過手術(shù)技巧的改進而徹底改善。由于冠心病患者術(shù)前既已發(fā)生心肌肥厚、纖維化等重構(gòu)改變，術(shù)后雖然心肌供血得以改善，但亦面臨心肌重構(gòu)發(fā)展、慢性充血性心力衰竭加重的問題，仍需服用減輕心肌重構(gòu)的藥物。同時移植橋管內(nèi)膜的增生所致遠期再狹窄必須予以預(yù)防和治療。很多患者同時還患有高血壓、糖尿病、高血脂和肥胖等相關(guān)疾病，如代謝綜合征。而這些疾病相互關(guān)聯(lián)，部分有著共同的機制。有學(xué)者試圖尋找某些藥物在使患者面臨多個問題時能同時獲益，槲皮素是其中之一。PMQ比槲皮素有更好的生物利用度、更容易經(jīng)胃腸吸收、血藥溶度更好，而且某些生物學(xué)特性更優(yōu)。之前由于PMQ獲得量少無法進行大劑量研究，目前工藝的改進突破了藥源瓶頸，可以更好地研究其藥理學(xué)特性。已有的研究表明PMQ的主要藥理作用有：抑制細胞增值；促NO釋放；抗氧化，包括直接的抗氧化活性和抑制煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 （nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶的活性。NADPH氧化酶是活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的主要源頭，并能調(diào)節(jié)其他途徑ROS的產(chǎn)生。ROS在心肌重構(gòu)、移植靜脈再狹窄、動脈粥樣硬化等的發(fā)生發(fā)展中均起重要作用，被認為是其重要的共同機制之一[6]，因此PMQ可能同時治療心肌重構(gòu)和移植靜脈的再狹窄。

皮下注射AngⅡ可誘導(dǎo)大鼠心肌重構(gòu)[7]。本實驗通過對行頸部靜脈移植模型的大鼠皮下注射AngⅡ誘導(dǎo)心肌重構(gòu)模擬接受搭橋或支架植入手術(shù)冠心病患者的體內(nèi)情況。結(jié)果表明PMQ能顯著減少實驗大鼠的心肌肥厚及纖維化的程度從而抑制心肌的重構(gòu)；同時PMQ能顯著抑制血管新生內(nèi)膜的形成。此結(jié)果提示PMQ能同時治療接受搭橋或支架植入手術(shù)的冠心病患者面臨的兩大主要問題。

隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們的生活方式的改變，許多冠心病患者同時合并多種疾病，病情復(fù)雜，而且這些將會相互作用，影響CABG的手術(shù)效果。如糖尿病、肥胖、高血壓、心力衰竭會加速再狹窄的發(fā)生，而冠脈血管的再狹窄又會加重心力衰竭。因此應(yīng)當(dāng)有一種方法，在分別治療的同時進行綜合治療這些相互關(guān)聯(lián)的疾病從而達到更好的治療效果。本實驗結(jié)果表明PMQ有作為治療那些行CABG或PTCA患者藥物的潛力。雖然PMQ在實驗中表現(xiàn)出來的效果并不是很理想，但即使是作為行CABG或PTCA患者的輔助治療性藥物，也值得進一步研究。

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