王 英

慢性腎臟病(CKD)發(fā)病率在我國逐年增多，部分患者最終會進展至終末期腎衰竭。因此，防治CKD已成為當前腎臟病領(lǐng)域研究的熱點問題。阿霉素腎病大鼠腎臟組織損傷的演變過程與人類腎臟病腎損害的慢性病理過程相似，也是研究慢性腎臟病腎小球硬化的經(jīng)典模型。氧化應(yīng)激在CKD病理生理過程中發(fā)揮著重要作用，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)已成為減輕腎臟損傷的關(guān)鍵。研究表明，冬蟲夏草具有改善細胞代謝，調(diào)節(jié)脂代謝、抗氧化應(yīng)激及抗纖維化等作用。本研究建立阿霉素腎病大鼠動物模型，觀察給予冬蟲夏草干預后大鼠腎組織抗氧化成分變化，探討其對腎損傷的保護作用及可能機制，為CKD的治療尋找新的途徑和手段。

1.材料和方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑:鹽酸阿霉素(深圳萬樂藥業(yè)有限公司);冬蟲夏草菌絲粉(杭州中美華東制藥有限公司);丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所);其余普通試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.2 儀器:日立7170A全自動生化分析儀;UV-754紫外分光光度計;光學顯微鏡(OLYMPUS)。

1.1.3 動物:雄性Wistar大鼠28只，8周齡，體質(zhì)量200～250g。

1.2 模型的建立、分組及給藥方法 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，所有大鼠隨機分為對照組(8只)、模型組(10只)和治療組(10只)。模型組和治療組大鼠，10%異戊巴比妥鈉溶液按1ml/kg量腹腔注射麻醉，腹部常規(guī)消毒，取左旁正中切口，切開皮膚，逐層進入腹腔，暴露左側(cè)腎臟，分離腎包膜，夾閉腎蒂后行腎臟切除，逐層關(guān)腹。對照組僅麻醉后打開腹腔，剝離腎包膜后即關(guān)腹，未行左腎切除術(shù)。將阿霉素用生理鹽水配制成0.2%溶液(1ml溶液中含2mg阿霉素)。于術(shù)后第7天按5mg/kg經(jīng)尾靜脈注射阿霉素，術(shù)后第28天按3mg/kg再次經(jīng)尾靜脈注射阿霉素，對照組注射等量生理鹽水。治療組大鼠，于第一次尾靜脈注射阿霉素后給予冬蟲夏草菌絲粉溶于蒸餾水5g/(kg·d)灌胃治療，共12周。模型組與對照組予等量清水灌胃。

1.3 標本收集 12周末用代謝籠準確收集24小時尿，離心保存于-70℃冰箱中待測;心臟采血，4℃離心后保存于-70℃冰箱待測;4℃預冷的生理鹽水反復灌洗右腎至顏色變蒼白，分離腎周包膜和筋膜，部分腎組織10%中性甲醛固定，石蠟包埋，制成厚度3μm切片，HE及PAS染色行腎臟病理檢查。其余腎組織分別切成小塊，置于液氮中凍透，然后轉(zhuǎn)入-70℃冰箱中待測。

1.4 觀察指標及測定方法 尿蛋白測定采用柳氮磺酸比濁法，尿肌酐測定采用苦味酸法，尿MDA測定采用硫代巴比妥酸法(Thibabituric Acid，TBA);血清肌酐(SCr)和血尿素氮(BUN)采用日立7170A自動生化分析儀進行檢測。計算肌酐清除率(Ccr)=尿肌酐×每分鐘尿量/血肌酐。

腎小球硬化指數(shù)(glomerulosclerosis index，GSI)計算:采用半定量的RAIJ法［3］，0=腎小球無病變，1=腎小球不超過25%受損，2=腎小球26% ～50%受損，3=腎小球51% ～75%受損，4=腎小球超過75%受損，每張切片至少計數(shù)20個腎小球積分，取均值×100。按如下公式計算腎小球硬化指數(shù):GSI=［(1×n1)+(2×n2)+(3×n3)+(4×n4)］/每張切片腎小球總數(shù)×100。

腎組織MDA含量及SOD、GSH-Px活性測定:取腎皮質(zhì)0.5克在冰浴條件下用冷生理鹽水制成10%組織勻漿，低溫離心機離心，取上清液待測。MDA采用TBA法，SOD活力采用聯(lián)苯三酚自氧化法，GSH-Px采用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)偶聯(lián)法，測定步驟嚴格按照試劑說明書進行。

2.結(jié)果

2.1 一般情況 模型組和治療組大鼠在注射阿霉素后出現(xiàn)毛色差、蜷縮拱背、體重增長緩慢、精神萎頓等表現(xiàn)。本實驗過程中，模型組大鼠死亡2只，治療組大鼠死亡1只，實驗結(jié)束時，共剩余大鼠25只:對照組8只，模型組8只，治療組9只。

2.2 各組大鼠尿蛋白及腎功能變化 模型組大鼠24小時尿蛋白定量、Scr和BUN水平較假手術(shù)對照組明顯升高(P＜0.05)，肌酐清除率降低(P＜0.05)，表明AIN大鼠造模成功。予冬蟲夏草灌胃治療12周后，24小時尿蛋白定量顯著減少(P＜0.05);Scr和BUN水平明顯下降(P＜0.05)，但仍高于假手術(shù)對照組(P＜0.05)，見表1。

表1 三組大鼠24小時尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮及肌酐清除率的變化()

表1 三組大鼠24小時尿蛋白、血清肌酐、血尿素氮及肌酐清除率的變化()

注:*與對照組比，P ＜0.05，#與模型組比，P ＜0.05。

組別 n 24小時尿蛋白定量(mg) SCr(μmol/L) BUN(mmol/L) Ccr(ml/min)對照組 8 15.96±3.82 45.36±6.98 5.87±0.62 5.21±0.32模型組 8 443.29±46.82* 104.68±13.53* 20.99±3.81* 1.11±0.05*治療組 9 319.75±32.51#* 86.55±8.02#* 11.04±2.24#* 2.35±0.34#*

2.3 各組大鼠腎小球硬化指數(shù)的比較 假手術(shù)對照組、模型組、治療組腎小球硬化指數(shù)分別為19.78±5.28，152.59±33.54，95.08±25.34。治療組腎小球硬化程度比模型組明顯減輕，差異具有顯著性(P＜0.05)，但仍重于假手術(shù)對照組(P＜0.05)。

2.4 各組大鼠腎組織與尿中MDA含量及腎組織SOD、GSH-Px活性的比較 模型組大鼠腎組織和尿中MDA含量較假手術(shù)對照組明顯增加(P＜0.05)，而腎組織SOD和GSH-Px活性則顯著下降(P＜0.05)，提示AIN大鼠腎臟氧化水平升高，處于氧化應(yīng)激狀態(tài);經(jīng)冬蟲夏草治療后，大鼠腎組織和尿中MDA含量下降，腎組織SOD和GSH-Px活性增加，差異具有顯著性(P＜0.05)，見表2。

表2 三組大鼠腎組織與尿中MDA含量及腎組織SOD、GSH－Px活性變化()

表2 三組大鼠腎組織與尿中MDA含量及腎組織SOD、GSH－Px活性變化()

注:*與對照組比，P ＜0.05，#與模型組比，P ＜0.05。

組別 n MDA(腎)(nmol/24h) MDA(尿)(nmol/mg Prot) SOD(U/mg Prot) GSH-Px(U/mg Prot)對照組 8 233.80±15.70 2.61±0.52 105.63±11.02 3.08±0.06模型組 8 545.30±29.40* 6.23±0.87* 42.34±5.46* 1.66±0.04*治療組 9 367.20±23.30#* 3.24±0.46#* 73.67±6.52#* 1.93±0.08#*

3.討論

本實驗所采用的動物模型是將大鼠左腎摘除，而后重復注射ADR誘導的加速的腎小球硬化模型。該模型鼠間差異小，重復性和穩(wěn)定性好，目前被認為是研究CKD進展較理想的動物模型［1］。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠尿蛋白明顯增加，血尿素氮和肌酐明顯升高，肌酐清除率下降，腎臟病理顯示模型組腎小球硬化指數(shù)明顯升高，細胞外基質(zhì)沉積增加，表現(xiàn)為腎小球硬化，表明模型制備成功。

腎臟氧供應(yīng)豐富，氧自由基產(chǎn)生的機會較多，現(xiàn)己公認，活性氧(ROS)對腎組織的損傷作用是腎臟病變的主要發(fā)病機制之一，甚至是許多細胞因子損傷腎組織的最終介質(zhì)。以往許多研究［2～4］表明在CKD進展過程中，氧化應(yīng)激發(fā)揮著重要的作用。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠腎組織和尿中MDA含量顯著升高，而抗氧化酶SOD和GSH-Px活性明顯下降，說明在該阿霉素腎病大鼠腎臟ROS產(chǎn)生增加，其抗氧化能力下降，導致活性氧在腎臟堆積，造成腎臟損傷，與文獻報道一致［3］。

冬蟲夏草是一種傳統(tǒng)中藥，含有多糖、氨基酸、脂肪酸及多種微量元素，應(yīng)用于慢性腎臟病的治療已有逾千年的歷史。已有研究證實冬蟲夏草能抑制自發(fā)性高血壓大鼠腎臟氧化應(yīng)激［5］，能減少糖尿病腎病大鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子和結(jié)締組織生長因子的表達［6］。但對阿霉素腎病大鼠腎損傷保護作用及機制目前尚未見報道。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)冬蟲夏草治療后，阿霉素腎病大鼠尿蛋白明顯減少，血尿素氮和肌酐下降，肌酐清除率升高，腎小球硬化指數(shù)明顯降低，提示冬蟲夏草對阿霉素腎病大鼠腎損傷具有保護作用。進一步的研究結(jié)果表明在冬蟲夏草干預下，阿霉素腎病大鼠腎組織和尿中MDA明顯減少，而抗氧化酶SOD和GSH-Px活性明顯增強，提示冬蟲夏草能抑制阿霉素腎病大鼠腎臟氧化應(yīng)激，減輕腎臟損傷。

綜上所述，冬蟲夏草可減輕阿霉素腎病大鼠的腎臟損害，其機制可能與拮抗腎臟氧化應(yīng)激有關(guān)。本研究結(jié)果可能為CKD的防治提供新的思路和手段。

1 王泰華，錢家麒.阿霉素腎病腎硬化動物模型的實驗改進［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，1997，6:191-193.

2 Masami S，Hideo H，Maki W，et al.Uremic Toxins Overload AcceleratesRenal Damage in a Rat Model of ChronicRenal Failure［J］.Nephron Exp Nephrol，2003，95:111-118.

3 Ceyssens B，Pauwels M，Meulemans B，et al.Increased oxidative stress in the mouse adriamycin model of glomerulosclerosis is accompanied by deposition of ferric iron and altered GGT activity in renal cortex［J］.Ren Fail，2004，26:21-27.

4 Li HY，Hou FF，Zhang X，et al.Advanced oxidation protein products accelerate renal fibrosis in a remnant kidney model［J］.J Am Soc Nephrol，2007，18:528-538.

5 唐榮，周巧玲.冬蟲夏草對自發(fā)性高血壓大鼠klotho表達及氧化應(yīng)激的影響［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2010，19(4):338-343.

6 周巧玲，劉抗寒，王衍慧.冬蟲夏草對糖尿病腎病模型鼠腎組織轉(zhuǎn)化生長因子B1、結(jié)締組織生長因子表達的影響［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2006，15(5):443-446.