李向利 宋會新 張術(shù)波

1.河北省遷西縣人民醫(yī)院胸外科，河北遷西 064300；2.華北煤炭醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北唐山 063000

食管癌是常見的十大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率與地理區(qū)域、飲食習(xí)慣、遺傳因素、和病毒感染等有關(guān)。其發(fā)生、發(fā)展涉及多因素、多步驟相互作用的復(fù)雜過程，且與多種基因的表達改變緊密相連[1]。故通過了解相關(guān)基因如何表達和調(diào)控機制，為探查食管癌的病因及治療提供新的理論基礎(chǔ)。近年來具有高致病性的人乳頭狀瘤?。℉PV）16/18與食管癌的相關(guān)性備受學(xué)者的關(guān)注。筆者收集唐山地區(qū)食管癌患者資料，探討HPV16/18感染和p53基因多態(tài)性與食管癌的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2005年5月～2010年11月在遷西縣人民醫(yī)院手術(shù)或胃鏡活檢共85例唐山地區(qū)食管疾病患者的新鮮食管組織標本，45例為食管癌患者，其中，男31例，女14例；年齡45～73歲，平均（56.7±5.8）歲；臨床分期按照國際食管癌會議制定的標準分期為Ⅰ期25例，Ⅱ期15例，Ⅲ期5例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移29例。另外20例良性腫瘤，20例正常食管組織。所有病例均經(jīng)術(shù)前快速冷凍病理和術(shù)后常規(guī)病理檢查確診，術(shù)前均行未化療、放療及免疫治療。

1.2 方法

1.2.1 HPV16/18的檢測 采用原位雜交試劑盒和生物素標記的高危HPV16/18 DNA探針，與蠟塊切片做DNA原位雜交。切片于60℃～70℃烘烤60 min脫蠟，置入雜交增強液里，高火加熱30 min，冷卻后用蒸餾水洗滌，滴加雜交液后蓋上蓋玻片，置原位PCR儀95℃變性5 min后，轉(zhuǎn)入含30%濕盒增效液的濕盒中，維持37℃過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）浸泡洗片，擦干后滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑，37℃孵育30 min，PBS浸泡洗片，擦干后滴加動物非免疫血清，室溫孵育20 min，PBS浸泡洗片，擦干后滴加DAB顯色液，室溫孵育10 min，PBS浸泡洗片，擦干后蘇木素復(fù)染。常規(guī)封片，鏡檢。試驗陽性對照:已知HPV16/18陽性的食管癌切片。

1.2.2 基因多態(tài)性分析 采用PCR-RFLP方法檢測p53基因第4外顯子72密碼子多態(tài)性。先行引物設(shè)計，引物序列（5'→3'），正向引物 CAACACCATAGCAGTAGCAGC，反向引物CAGCCTCTCCTTCATACAGCC，按照試劑盒使用說明書對食管癌患者癌組織及其他標本提取DNA模板，而后行p53基因第四外顯子PCR擴增，利用限制性內(nèi)切酶對PCR擴增產(chǎn)物酶切后用2%的瓊脂糖凝膠電泳分析，在凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果。

1.3 結(jié)果判斷

HPV16/18原位雜交陽性信號為棕黃色顆粒，主要定位在細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)。對腫瘤細胞的觀察標準，陽性（+）:細胞核或質(zhì)內(nèi)見棕黃色顆粒，陰性（-）:細胞不著色。p53基因不同形態(tài)鑒定:僅在413 bp處顯示條帶的為Pro/Pro基因型，分別在253 bp和160 bp處出現(xiàn)條帶的為Arg/Arg基因型，而在413 bp、253 bp、160 bp均有條帶出現(xiàn)的為Pro/Arg基因型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPVl6/18感染與食管癌患者不同部位組織中的表達情況

食管癌組織、良性腫瘤和正常組織中HPV16/18的感染情況45例食管癌組織中，HPV16/18陽性40例（88.9%），良性腫瘤中HPV16/18陽性2例（5.0%），正常組織中HPV陽性1例（2.5%），食管癌、良性腫瘤和正常組織中HPV16/18陽性率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 HPV16/18感染與食管癌患者不同部位組織中的表達情況

2.2 p53基因多態(tài)性在不同標本中的分布

食管癌、食管良性腫瘤和正常患者中三種基因型分布情況如下，在食管癌患者組織標本中各基因型分布頻率分別為Pro/Pro基因型占20%，Arg/Arg基因型占42.2%，Pro/Agr基因型占37.8%；食管良性腫瘤組織標本中各基因型分布頻率分別為Pro/Pro基因型占20%，Arg/Arg基因型占35%，Pro/Agr基因型占45%；在正常組織標本中各基因型分布頻率分別為Pro/Pro基因型占20%，Arg/Arg基因型占20%，Pro/Agr基因型占60%。見表2。

表2 p53基因多態(tài)性在不同組別標本中的分布

2.3 p53基因多態(tài)性與HPV16/18感染的關(guān)系

在食管癌患者癌組織中，HPV16/18檢測陽性者各基因型所占比例分別為純合子Pro/Pro基因型17.8%，Arg/Arg基因型42.2%，雜合子Pro/Arg基因型40.0%，HPV16檢測陰性者各基因型所占比例分別為Pro/Pro基因型37.5%，Arg/Arg基因型5.3%，Pro/Arg基因型5.6%；在患者癌組織中三種基因型構(gòu)成比在HPV16/18感染組和未感染組差異經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而在食管良性腫瘤患者和正常對照組標本中，三種基因型構(gòu)成比的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05）。見表 3。

表3 p53基因多態(tài)性與HPV16/18感染的關(guān)系

3 討論

全世界每年食管癌發(fā)病人數(shù)大于30萬，其中一半在中國。其中環(huán)境因素、亞硝胺及營養(yǎng)因素為食管癌的主要病因因素，但其確切病因及發(fā)病機制仍未明了，因此展開了大量針對食管癌的分子生物學(xué)研究，其目的就是為了找出食管癌確切病因及發(fā)病機理，這為食管癌疾病臨床的早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早治療起著決定性的作用[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)HPV感染可能在食管上皮癌變中也起一定作用，并認為HPV感染下，可刺激或逐步引導(dǎo)并最終破壞原癌基因與抑癌基因之間相互依存、相互制約的平衡，致使細胞信號傳導(dǎo)和細胞周期紊亂，使突變細胞出現(xiàn)異常增殖。目前p53基因已成為研究比較透徹的一種抑癌基因，一致認為其與細胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細胞分化、細胞凋亡等重要的生物學(xué)功能有關(guān)。該基因的缺損或突變常常被證實與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，自1998年首次報道p53第72密碼子基因多態(tài)性與腫瘤的關(guān)系，有關(guān)p53多態(tài)性的研究越來越引起學(xué)者的興趣[3]。HPV是小分子DNA病毒，目前已有一百余種分型，分為高危型和低危型兩種，其中高危型主要是有惡變傾向，以HPV16/18為首，可導(dǎo)致p53喪失抑癌作用[4]。因此，發(fā)現(xiàn)早期診斷的特異性分子指標和手段已成為食管癌研究中的重要方向。

本研究顯示食管癌組織、良性腫瘤和正常組織中HPV16/18的感染情況45例食管癌組織中，HPV16/18陽性40例（88.9%），良性腫瘤中HPV16/18陽性2例（5.0%），正常組織中HPV陽性1例（2.5%），在食管癌組織中的HPV16/18陽性表達明顯高于良性腫瘤和正常食管組織，根據(jù)體外研究認為其編碼的E6蛋白能與p53蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，使其失去抑癌作用，促使細胞的增殖，相關(guān)研究顯示HPV的感染存在地域性特征，并認為HPV的感染成為該地區(qū)食管癌高危因素，與本研究結(jié)果相一致[5]。HPV16/18高表達可促進正常細胞的惡變和食管癌細胞的增殖侵潤，考慮野生型p53蛋白半衰期短，具不穩(wěn)定性，不易檢測，突變型P53蛋白其具有癌基因活性，可引起細胞惡性增殖且具有抗凋亡作用，導(dǎo)致細胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生，使檢測成為可能，發(fā)生腫瘤時P53蛋白的大量表達均為突變型P53蛋白，其不再具有抑癌作用，而是促進細胞增殖。本研究顯示p53基因第72密碼子多態(tài)性在食管癌患者中Arg/Arg基因型占42.2%，明顯高于良性腫瘤和正常食管組織中的35%和20%。在p53基因多態(tài)性與食管癌關(guān)系方面研究認為Arg/Arg純合子基因型可能是食管癌的易感因素，與本文研究相同，但也有報道認為Por純合子攜帶者將增加患食管癌的風險[6-7]。對于p53基因多態(tài)性與HPV16/18感染的關(guān)系，本研究認為HPV感染和Arg/Arg基因型有共存性。而在食管良性腫瘤患者和正常食管組織中則未見相關(guān)性。有相關(guān)研究認為癌組織中p53該位點的基因類型存在突變的可能，各個基因類型頻率均不等，認為其與HPV16/18感染有關(guān)，與本實驗結(jié)果相同。其發(fā)生的原因可能是由于HPV16/18感染后，產(chǎn)生并分泌的特殊蛋白E6具有與P53結(jié)合并促進P53突變與降解，使P53原有功能的喪失，但其通過何種機制產(chǎn)生該效果仍有待于進一步研究[8]。

綜上所述，本文結(jié)果初步提示高危HPV感染與唐山的食管癌發(fā)生有關(guān)。聯(lián)合檢測食管癌中的HPV感染和Arg/Arg基因型的P53表達有助于評價食管癌的生物學(xué)行為。

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