胡治遠，趙運林 ，劉石泉，李燕子，許永立

(1.湖南城市學院化學與環(huán)境工程學院，湖南益陽 413000;2.湖南農(nóng)業(yè)大學食品科技學院，湖南長沙 410128;3.湖南農(nóng)業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院，湖南長沙 410128)

引 言

茯磚茶屬于黑茶類，以加工方法復雜、口味獨特而著稱?！鞍l(fā)花”工序是形成茯磚茶品質(zhì)的關(guān)鍵工藝，國家標準中規(guī)定特茯和普茯均應(yīng)達到“發(fā)花普遍茂盛”的水平［1］，而“發(fā)花”過程的實質(zhì)則是控制一定的溫度與濕度，促使微生物在茶葉內(nèi)大量繁殖以達到改善其品質(zhì)的目的。對于發(fā)花過程中的微生物，先前茶葉學者們作過較多研究［2－10］，最終將優(yōu)勢微生物確認為冠突散囊菌(表1)。而據(jù)資料顯示［11］，目前我國不同茶葉產(chǎn)區(qū)分離出來的冠突散囊菌有四種以上不同類型，是否屬于原菌株的變種(型)或是亞種，還有待考證。本研究選取湖南地區(qū)不同產(chǎn)地的茯磚茶樣品，分離純化并保存其中冠突散囊菌，對各菌株形態(tài)特征的差異性進行探討，并與冠突散囊菌標準菌株進行比較，以期為冠突散囊菌的地域性差異、不同生理小種的發(fā)現(xiàn)與命名提供實驗基礎(chǔ)，并為茯磚茶生產(chǎn)提供優(yōu)質(zhì)的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 不同茯磚茶樣品 從湖南益陽、安化、臨湘、岳陽采取具有代表性的茯磚茶樣品7種(表2)，并置于陰涼避光處保存。

表1 歷年學者對茯磚茶中優(yōu)勢微生物的鑒定結(jié)果Tab.1 Advantage microbial appraisal result in the brick tea of previous scholars

表2 供試茶樣及來源Tab.2 The tea samples and their sources

1.1.2 冠突散囊菌標準菌株 菌株GBZ1從金湘益牌茯磚茶(湖南益陽茶廠有限公司，2009)內(nèi)分離獲得，已由廣東微生物研究所鑒定為冠突散囊菌(Eurotiμm cristatμm)，無 性 型 名 稱 為 小 冠 曲 霉(Aspergillus cristatellus)，在本研究中選取GBZ1作為冠突散囊菌標準菌株。

1.1.3 主要藥品與試劑NaCl、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸亞鐵、蔗糖、瓊脂粉。

1.1.4 主要儀器設(shè)備 恒溫振蕩儀(SHA-Ea)、單人超凈工作臺(SW-CJ-IFD)、恒溫生化培養(yǎng)箱(LRH-250)、超低溫冰箱(DW-FW251)、立式壓力蒸氣鍋(LDZX-75KBS)、艾柯純水機(AKSW-V-8)、磁力加熱攪拌器、電子天平(FC104)、電子顯微鏡(JSM-6380LV)、中藥粉碎機(GX-15A)。

1.1.5 培養(yǎng)基的選擇

(1)察氏培養(yǎng)基

稱取 3 g、氯化鉀 0.5 g、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)0.5 g、1 g、硫酸亞鐵0.01 g、30 g、瓊脂20 g、蒸餾水定容至1000 mL，煮沸并攪拌均勻，高壓滅菌備用。用于優(yōu)勢菌株的分離與培養(yǎng)。

(2)C20 培養(yǎng)基［12］

提高蔗糖濃度到20%，其他配方與察氏培養(yǎng)基相同。用于各菌株的電鏡制片觀察。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶葉樣品稀釋平板培養(yǎng) 將茶葉樣品用中藥粉碎機粉碎，稱取粉碎后的樣品25 g，放置在含225 mL無菌生理水與玻璃珠的500 mL三角瓶內(nèi)，蓋上封口膜，在振蕩儀上200 r/min振搖30 min，使其中微生物充分分散，制成10－1倍樣品稀釋液。在超凈工作臺上用梯度稀釋法得到10－5倍樣品稀釋液，用移液槍取1 mL該稀釋液轉(zhuǎn)到察氏平板上并用涂布器涂布均勻，放置在恒溫箱內(nèi)28℃靜置培養(yǎng)，每個茶葉樣品各設(shè)置4個重復。

1.2.2 冠突散囊菌的分離與純化 選擇長有“金花菌”的平板，用接種針挑取長勢較好的菌落，于察氏平板上進行劃線分離，這樣反復3～4次后獲得純培養(yǎng)的菌株，轉(zhuǎn)接斜面，置于4℃冰箱內(nèi)保存。

1.2.3 冠突散囊菌的平板培養(yǎng)與形態(tài)觀察 取4℃保存的菌株在常溫下復蘇24 h后，三點式轉(zhuǎn)接于察氏平板與C20平板，置于培養(yǎng)箱內(nèi)28℃靜置培養(yǎng)，每天觀察菌落的生長情況并作好記錄。

1.2.4 冠突散囊菌的掃描電鏡觀察 挑取C20平板上生長到適宜大小的菌落制成標本并固定［13］，常規(guī)法制片后，在掃描電子顯微鏡下觀察觀察其菌絲、閉囊殼、子囊、子囊孢子、分生孢子頭等形態(tài)并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 各菌株的形態(tài)特征依據(jù)各菌株在察氏平板上的培養(yǎng)特征與電鏡下閉囊殼、子囊孢子、分生孢子頭與分生孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖1－8)，得到表3、表4、表5。

2.1.1 冠突散囊菌標準菌株形態(tài)特征 標準菌株GBZ1(圖1)的形態(tài)特征為:察氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d時菌落直徑為21－24 mm，菌落形狀為較規(guī)則的圓形，菌落中央厚度略高于邊緣，中心有小隆起。菌落結(jié)構(gòu)較致密，邊緣呈淺黃色，往中央顏色逐漸加深，由淺黃漸變?yōu)轾Z黃，到菌落中央變?yōu)殚蠙旌稚?。生長時間較長的部位有少許黑褐色香油狀滲出液，菌落周圍的培養(yǎng)基亦被色素染成茶褐色。生殖結(jié)構(gòu)以閉囊殼為主，菌落邊緣可見少量灰綠色分生孢子頭。菌落老化后(14 d)，直徑達27－34 mm，仍為較規(guī)則的圓形，菌落邊緣變成鐵銹色，中心為灰綠色，產(chǎn)生大量閉囊殼結(jié)構(gòu)。

表3 各菌株察氏平板主要特征(7 d)Tab.3 The main characters of strains in czapek's solution(7 d)

表4 各菌株察氏平板主要特征(14 d)Tab.4 The main characters of strains in czapek's solution(14 d)

表5 各菌株電鏡下主要結(jié)構(gòu)的大小Tab.5 The main structure of the size by electron microscopy strains

其電鏡下特征為:分生孢子頭呈疏松放射形，孢子梗生自基質(zhì)，長度140－300 μm，直徑為6－10 μm，壁光滑;頂囊近球形或燒瓶形，直徑12－25 μm;瓶梗6.5 －10 μm ×2.5 －3.4 μm，著生于頂囊上半部。分生孢子呈橢球形，中心有凹槽，外壁粗糙具小刺，孢子體大小為 4.4 －5.0 μm ×3.2 －3.8 μm。閉囊殼為球形或近球形，直徑110－160 μm;子囊為球形，10－14 μm;子囊孢子呈雙凸鏡形，有兩個明顯的縱向雞冠狀突起，孢子體大小為5－6 μm×4－5 μm，凸面比較粗糙，具尖疣。這與之前學者［6，9］對冠突散囊菌形態(tài)特征的描述基本相一致。

2.1.2 冠突散囊菌近似菌株 菌株 G1、G2(圖2、圖3)的平板形態(tài)與標準菌株相似度較高，其電鏡下各結(jié)構(gòu)特征也與標準菌株基本一致。

2.1.3 冠突散囊菌變型Ⅰ 菌株G3(圖4)與標準菌株大體相似。其差異之處為:老化的菌落較大，直徑在32～45 mm之間，且菌落形狀不規(guī)則，邊緣生長呈輻射狀;菌落中心為鐵銹色至紅褐色，離菌落中心三分之二處有一條灰綠色暈圈。

2.1.4 冠突散囊菌變型Ⅱ G4(圖5)生長速度與標準菌株接近。培養(yǎng)7 d時，菌落直徑在22～27 mm之間，菌落形狀接近球形，結(jié)構(gòu)較致密，邊緣為淺黃至鵝黃色，中心部位仍然呈橄欖褐色。與標準菌株區(qū)別為產(chǎn)褐色素較少，菌落鵝黃色區(qū)域所占面積較大;其子囊孢子體大小為 5.6 －6.4 μm ×4.2 －5.1 μm，比標準菌株略大，子囊孢子外壁上呈現(xiàn)較多不規(guī)則條紋，比標準菌株更為粗糙。

2.1.5 冠突散囊菌變型Ⅲ 菌株G5、G6(圖6、圖7)與標準菌株差異較大。其生長速度較快，7 d時菌落直徑達25～39 mm，形狀為不規(guī)則球形，菌落中心有少量不規(guī)則褶皺，產(chǎn)褐色素均較少。成熟閉囊殼為球形或近球形，直徑在140－190 μm之間，閉囊殼外壁較為光滑。其子囊孢子比標準菌株略小，大小在 4.2 －5.2 μm ×3.7 －4.4 μm 之間。

2.1.6 冠突散囊菌變型Ⅳ G7(圖8)菌落生長速度較快，7d時直徑達26～31 mm，形狀為近球形，產(chǎn)生少量滲出液。其子囊孢子大小為5.4－5.8 μm×3.6 －4.8 μm，與標準菌株相比更加扁平，孢子體雙凸鏡特征不夠明顯，其他特征與冠突散囊菌標準菌株基本一致。

3 討論

在當今真菌的分類學研究中，主要是以孢子形態(tài)與子實體形態(tài)特征為主要分類依據(jù)，同時參照細胞結(jié)構(gòu)，生理生化和細胞特征等［14］。通過顯微鏡尤其是電子顯微鏡對其細胞構(gòu)造、無性及有性生殖結(jié)構(gòu)特點、孢子形狀和顏色等的觀察描述成為了真菌分類的可靠手段［15］。本研究從形態(tài)特征上對七株來自湖南不同地區(qū)的冠突散囊菌進行了詳細描述與比較，為冠突散囊菌的多樣性研究與優(yōu)良菌種的篩選提供了實驗基礎(chǔ)。

研究結(jié)果表明，七株實驗菌株均基本符合中國真菌志［12］與 Raper的專著［16］中對冠突散囊菌的描述，如子囊孢子都具有冠狀的突起與粗糙具尖疣的表面、分生孢子壁具小刺、在察氏培養(yǎng)基上可正常生長等，由此可以鑒定七株菌株都屬于冠突散囊菌。而包括GBZ1在內(nèi)的八株菌株在形態(tài)特征上表現(xiàn)出四類較為明顯的生理分化(表6)。其中G1、G2與標準菌株在形態(tài)特征上較為相似，其來源茯磚茶產(chǎn)自益陽和安化地區(qū)，說明較小的地理隔離并未使它們產(chǎn)生遺傳上的差異。G3在培養(yǎng)形態(tài)上與GBZ1有一些差異，老化后的菌落周邊呈輻射狀蔓延，電鏡下特征基本一致;G7的生長速度和子囊孢子形態(tài)與GBZ1有一定差異;G4、G5、G6與標準菌株的差異均較大，其中G4與標準菌株有3處差異，菌株來源茶葉為1979年產(chǎn)陳年茯磚茶，推測是在數(shù)十年的保存過程中，菌株發(fā)生了一定程度的變異;G5、G6與標準菌株有4處差異，其來源茯磚茶分別產(chǎn)自臨湘與岳陽，可能是在地理隔離與不同生產(chǎn)環(huán)境的影響下，菌株基因發(fā)生改變從而導致形態(tài)特征上的差異。根據(jù)中國真菌志［12］對曲霉屬變型的定義，菌株G3－G7極有可能屬于冠突散囊菌原種的變型。為了便于之后進一步研究的開展，本研究依據(jù)形態(tài)特征上的典型差異對各個菌株予以初步命名:將G3命名為蔓延冠突散囊菌(Eurotium cristatum spread Zhao)、G4命名為鵝黃冠突散囊菌(Eurotium cristatum light yellow Zhao)、G5與G6命名為褶皺冠突散囊菌(Eurotium cristatum drape Zhao)、G7命名為異冠冠突散囊菌(Eurotium cristatum variecolor Zhao)。對于冠突散囊菌種下各單位的進一步鑒定，如采用現(xiàn)代分子生物技術(shù)等，以及對其發(fā)酵產(chǎn)物安全性與生物活性的檢測，還有待進一步探討。

表6 不同生理小種與標準菌株的區(qū)別以及初步命名Tab.6 The difference between different biological strain ＆ standard strain and preliminary designation

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