李 忠，鐘瑩瑩，王志達，陳逸湘，凌宏通，宋 斌

(1.梅州市微生物研究所，廣東 梅州 514071；2.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070)

靈芝 (Ganoderma lucidum)隸屬于擔子菌綱、多孔菌目、多孔菌科、靈芝屬，是中國傳統(tǒng)的藥用真菌，被稱為神草，在我國已有2000多年的藥用歷史[1]。靈芝中含有靈芝多糖、三萜類化合物、核苷、氨基酸、甾醇、生物堿等多種成分[2-4]。大量藥理研究表明，靈芝具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老、護肝和降血糖血脂等方面的作用[2-7]；臨床上還應(yīng)用于美容、改善記憶和改善睡眠等方面[2,8]。靈芝資源市場需求量大，開發(fā)前景廣闊。通過對5個赤靈芝菌株的比較試驗，篩選出適宜梅州及其周邊地區(qū)生長的靈芝菌株，以期為靈芝的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

雜交靈芝種、廣1號靈芝種，從廣東省農(nóng)科院蔬菜研究所引進；大別山G8靈芝種，由廣州寶興生物科技有限公司梅州靈芝實驗基地提供；梅州本地靈芝種，由梅州市微生物研究所提供；三明京大靈芝種，從福建省三明真菌研究所引進。

1.2 培養(yǎng)基配方

母種培養(yǎng)基：馬鈴薯汁 20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、瓊脂2%，加水至1 000 mL。

原種培養(yǎng)基：玉米粒99%、石膏1%。

栽培料配方：木屑78%、麥麩12%、玉米粉8%、石膏 1%、糖 1%。

1.3 母種的制作

取馬鈴薯200 g，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸20 min，紗布過濾，再加20 g葡萄糖和20 g瓊脂及其它藥品，充分溶解后補足水至1 000 mL，分裝入21 mm×200 mm試管中，每試管約10 mL，121℃滅菌30 min后取出試管擺斜面至冷卻。在超凈工作臺內(nèi)定量接入平板尖端菌絲，每個菌株接10支，25℃恒溫培養(yǎng)。

1.4 原種的制作

玉米粒除雜、除壞，水浸泡12 h～13 h后，沸水煮至用手按開玉米粒里面不糊為宜，晾干至表面無水，加入石膏拌勻，混合裝袋，每袋折合干料80 g，121℃滅菌1.5 h，冷卻后在超凈工作臺內(nèi)定量接入平板尖端菌絲，每個菌株接20瓶，25℃恒溫培養(yǎng)。

1.5 栽培方法

將木屑78%、麥麩12%、玉米粉8%、石膏1%、蔗糖1%混勻，按料∶水=1∶1.5加水拌勻，拌好后分裝到33 cm×17 cm×0.05 cm的聚丙烯塑料袋中，每袋裝折合干料350 g，121℃滅菌2 h，自然冷卻后在超凈工作臺內(nèi)定量接入原種，每個菌株接150袋～200袋，室溫培養(yǎng)。菌絲滿袋后開袋，待菌蓋白色生長圈基本消失呈紅褐色時移入收粉架，保證濕度，定期通風，約40 d后可采收孢子粉和子實體[9,10]。

1.6 拮杭試驗

拮抗試驗是鑒定菌株間遺傳差異的傳統(tǒng)方法，通過拮抗試驗將供試菌株進行鑒定、歸類，避免重復[11]。菌絲間的拮抗反應(yīng)是菌株間不同遺傳特性的重要表現(xiàn)，表明不同菌株分別屬于不同的親和群。實驗將0.5 cm2的菌塊接種到PDA平板上，25℃恒溫培養(yǎng)5 d～8 d得到活化菌種。在活化后的菌落邊緣取直徑5 mm的菌塊，按3個菌株以“品”字形同時接種在一個PDA平板上 (直徑9 cm，接種塊間相距3.5 cm)，25℃恒溫培養(yǎng)，每天定時觀察菌株間是否有拮抗線，以及拮抗線是否明顯。每個組合重復3次。

1.7 試驗結(jié)果觀測

母種萌發(fā)后每天劃線，測量并記錄菌絲生長速度，記錄菌絲長滿試管的時間以及菌絲的濃密程度、顏色、氣生菌絲量等情況。原種待菌絲長到瓶肩部時開始沿菌絲生長邊緣劃線，測量并記錄菌絲生長速度、滿瓶時間以及菌絲的濃密程度等。栽培中觀察記錄原基形成時間、采收時間，觀察子實體的生物學性狀，包括菌蓋顏色、菌蓋面積、菌柄長度，并記錄出芝產(chǎn)量，計算污染率、生物學效率等數(shù)據(jù)。靈芝孢子粉作為靈芝的精華，它集中了靈芝的最有效成分[12]，因此梅州赤靈芝栽培以收孢子粉為主、子實體為輔，試驗中只測第1潮靈芝產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試靈芝菌株間菌絲的拮抗性

拮抗試驗表明，多數(shù)接種在同一平板上的供試菌株在培養(yǎng)6 d后開始出現(xiàn)拮抗線，5個靈芝菌株間菌絲的拮抗反應(yīng)見表1。

除了本地菌株與三明菌株之間無明顯拮抗現(xiàn)象外，其它菌株之間均存在拮抗反應(yīng)，因此可以推測至少4個靈芝菌株親緣關(guān)系較遠，分屬不同親和群，是互不相同的靈芝菌株，不存在異名同種現(xiàn)象。

表1 供試菌株的拮抗反應(yīng)

2.2 不同靈芝菌株母種試驗結(jié)果

不同靈芝菌種在母種培養(yǎng)基上的生長狀況見表2。

表2 不同靈芝菌種在母種培養(yǎng)基上的生長狀況

由表2可以看出，5個赤靈芝菌株在母種培養(yǎng)基上的生長速度各不相同，其中雜交靈芝其生長速度最快，滿管天數(shù)最短，其次是廣1號；菌株三明和G8生長速度差不多，滿管天數(shù)相同，都是14 d；而本地菌株其生長速度相對較慢，滿管天數(shù)也要較長時間，需要18 d。從菌絲的生長形態(tài)來看，雜交和廣1號氣生菌絲多，其它3個菌株相對較少。從菌絲密度、菌絲顏色、菌絲的邊緣整齊度來看，5個菌株都差不多，菌絲濃密，顏色雪白，邊緣較整齊?？偟膩砜矗s交靈芝菌株在母種培養(yǎng)基中的生長狀況最好，其菌絲長勢好、生長速度快，菌絲濃密雪白、邊緣整齊。

2.3 不同靈芝菌株原種試驗結(jié)果

不同靈芝菌株在原種培養(yǎng)基中的生長狀況見表3。

表3 不同靈芝菌株在原種培養(yǎng)基中的生長狀況

從表3可以看出，雜交菌株在原種培養(yǎng)基中的生長速度最快，滿瓶天數(shù)最短，但是其菌絲生長速度相對于在母種培養(yǎng)基的生長速度就減慢了。而其它4個菌株相對于母種培養(yǎng)基的生長速度都有不同程度的加快，5個菌株的菌絲滿瓶天數(shù)差值相對較小，沒有母種時的差別那么大。此外，5個靈芝菌株在原種培養(yǎng)基中的菌絲萌發(fā)和定殖能力都比較強，菌絲密度較密，色澤雪白。

2.4 不同靈芝菌株栽培試驗結(jié)果

2.4.1 靈芝菌株在栽培袋中的生長狀況

根據(jù)廣東梅州當?shù)卮笠?guī)模栽培赤靈芝的實際情況，實驗選擇室溫下培養(yǎng)栽培袋菌株。不同靈芝菌株在栽培袋中的生長狀況見表4。

不同靈芝菌株在各階段所需要的時間見圖1。

由于正值冬季氣溫較低，生長相對較慢，從表4可見，5種菌株菌絲滿袋所需天數(shù)依次為雜交＜廣1號＜G8＜本地＜三明。同表2、表3菌絲生長速度次序變化不大，只有三明種在室溫下生長速度較之為慢。從污染率來看，雜交菌株較之其它4個菌株較低只有1.65%，但5個菌株的污染率都在正常范圍 (5%)之內(nèi)。此外從圖1可以看出，開袋后雜交菌株原基形成最慢，菌蓋形成到子實體成熟所需時間短，子實體積蓄養(yǎng)分時間與其余4個菌株各階段所需時間相差都不遠，尤其是菌蓋形成到子實體成熟所需時間都較長，均超過12 d，因此子實體積蓄養(yǎng)分均較充足。

2.4.2 不同靈芝菌株子實體生物學性狀比較

不同靈芝菌株子實體生長特性統(tǒng)計參數(shù)見表5。不同靈芝菌株子實體生長特性比較見表6。

表5 不同靈芝菌株子實體生長特性統(tǒng)計參數(shù)

從表5統(tǒng)計參數(shù)可知，雜交菌株的子實體和其它4個菌株差別較大，分支數(shù)多、菌柄長且直徑小、菌蓋薄且小，同時畸形率很高，達46.15%；而其它4個菌株的子實體生長特性參數(shù)差別相對較小。從表6來看，子實體顏色都是紅褐色，只是雜交菌株的子實體顏色較淡；子實體形狀差別較大，子實體大小不一、菌柄長短不一、菌蓋邊緣規(guī)整程度不同；但也有相似之處，子實體都是叢生，出芝也較整齊，除雜交子實體是近圓形外，其它的都是腎形。

表6 不同靈芝菌株子實體生長特性比較

2.4.3 不同靈芝菌株的產(chǎn)量及生物學效率比較

根據(jù)梅州栽培赤靈芝的特點，只對第1潮產(chǎn)的子實體和孢子粉進行統(tǒng)計。不同靈芝菌株產(chǎn)量比較見表7。

由表7可見，無論是子實體還是孢子粉，本地和G8兩菌株的產(chǎn)量都明顯高于其它3個菌株，其生物學效率也明顯高于其它菌株。其中本地菌株生物學效率最高，達14.57%；雜交菌株生物學效率最低，只有6.50%。從孢子粉產(chǎn)量來看，本地菌株產(chǎn)量最高，為8.99 g，占干料的2.57%；其次是G8菌株為8.88 g，占干料的2.54%。因此，從收集孢子粉角度來看，本地和G8兩菌株是適合梅州生產(chǎn)推廣的優(yōu)良菌株。

表7 不同靈芝菌株產(chǎn)量比較

3 討論與小結(jié)

通過拮抗實驗發(fā)現(xiàn)，本地菌株與三明菌株之間無明顯拮抗現(xiàn)象和菌絲倒退現(xiàn)象。推測這兩個菌株親緣關(guān)系較近，可能存在異名同種現(xiàn)象，需要做進一步的驗證實驗。

通過比較試驗可以看出，雜交靈芝菌株的母種、原種和栽培袋中的菌絲生長速度都是最快，菌絲活力和適應(yīng)性較強。同時栽培袋污染率低，但是出菇晚、子實體成熟早、營養(yǎng)積蓄少，子實體菌蓋的增大和加厚不充分，生物學效率低，這可能與菌株本身是雜交而成有關(guān)系。但雜交菌株生長周期短，污染率底，菌蓋不規(guī)則，可能更適合于做盆景。

三明和廣1號兩菌株相對于其它3個菌株，具有菌絲生長速度快、污染率低等特點，但生物學效率不高，子實體雖然大但厚度薄，孢子粉產(chǎn)量偏低，不利于作為優(yōu)良菌株在梅州應(yīng)用推廣。而G8和本地2個菌株菌絲雪白濃密，氣生菌絲量多，子實體原基形成快，菌蓋大小適中且厚實，出芝較整齊，子實體形狀和色澤好，產(chǎn)孢量多，生物學效率高，具有較高的商品價值。綜上所述，G8和本地2個菌株在梅州氣候條件下栽培的子實體生物學性狀好、產(chǎn)孢量多、生物學效率高，是適合本地區(qū)生產(chǎn)推廣的優(yōu)良菌株。

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