許 峰，劉 宇，尹永剛，王守現(xiàn)，張英春，趙 爽，耿小麗

（北京市農(nóng)林科學院植物保護環(huán)境保護研究所，北京 100097）

杏鮑菇（Pleurotus eryngii）又名刺芹側(cè)耳，是近年來開發(fā)栽培成功、適于工廠化栽培的珍稀食用菌新品種，其風味獨特、營養(yǎng)豐富[1]，能夠產(chǎn)生多種生物活性分子和酶[2]，且其多糖具有較好的降血糖、增強肌體免疫功能、抗腫瘤和抗氧化活性[3]。因此杏鮑菇具有很高食用、藥用、經(jīng)濟和生態(tài)價值，市場前景廣闊。據(jù)北京食用菌協(xié)會統(tǒng)計，杏鮑菇在北京市場上已經(jīng)占食用菌總產(chǎn)量的5.01%。

杏鮑菇遺傳多樣性研究的開展，對杏鮑菇優(yōu)良品種的雜交選育、種質(zhì)資源的保護有著重要的意義。Ro等[4]、尚曉冬等[5]和劉曉紅等[6]分別對其收集的不同地區(qū)的杏鮑菇菌株進行了RAPD技術(shù)分析，但是，針對北京地區(qū)主要栽種品種和工廠化生產(chǎn)的杏鮑菇菌株的RAPD分析未見報道。為此，本研究應用RAPD分子標記技術(shù)，對北京地區(qū)24個杏鮑菇菌種進行遺傳多樣性分析，為有效培育杏鮑菇優(yōu)良新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗材料

本研究所用菌株的名稱及來源參見表1。

1.1.2 試劑

葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4等化學試劑均為分析純試劑，購自國藥集團北京化學試劑公司；Taq E、dNTP等分子生物學試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司；所用引物由上海生工生物公司（Sangon）合成。

1.1.3 儀器

PCR儀 （Eppendorf Mastercycler Rradien）t、凝膠成像系統(tǒng) （Bio-Rad）、紫外可見分光光度計 （Labtech UV9100）、電泳儀（北京六一DYY-Ⅲ-12B）、電子分析天平（奧豪斯）、臺式高速冷凍離心機（Eppendorf 5415R）、移液器（Eppendorf）等。

表1 供試菌株及其來源

1.1.4 培養(yǎng)基

固體綜合PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨 5 g、 KH2PO43 g、MgSO41.5 g、瓊脂 20 g、VB110 mg，水 1 000 mL。

1.2 方法

1.2.1 RAPD分析

取PDA平板上活化7 d~10 d的杏鮑菇菌種，刮取少量菌絲作為試驗材料，DNA的提取參照許峰等[7]的方法，RAPD擴增反應體系及擴增程序參照范英等[8]的方法。取9 μL PCR擴增產(chǎn)物，1.3%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠經(jīng)EB染色后，置于紫外凝膠成像系統(tǒng)上觀察并拍照記錄。

1.2.2 數(shù)據(jù)處理及分析

同一水平上將擴增出的強帶或可分辨性好的弱帶，均視為擴增陽性賦值“1”，未擴增出條帶視為擴增陰性賦值“0”，用NTSYSpc 2.10軟件進行聚類分析及主坐標分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株RAPD分析結(jié)果

以提取的24個供試杏鮑菇菌株的基因組DNA為模板，通過對40條引物的PCR擴增篩選所獲得的9條引物（表2），在供試菌株上電泳效果較好，每個菌株都可以通過PCR擴增出DNA條帶,且條帶穩(wěn)定、清晰、重復性好、分布合理。9條引物共擴增出142條DNA片段，不同引物擴增出的DNA條帶數(shù)從10個~20個不等，其分子量絕大多數(shù)為250 bp~2 000 bp，其中包含了豐富的DNA多態(tài)信息 （圖 1）。

表2 RAPD分析用引物

圖1 引物S484對24株杏鮑菇菌株的擴增結(jié)果

2.2 供試菌株聚類分析結(jié)果

綜合了9條RAPD隨機引物擴增出的142條多態(tài)性片段，用NTSYSpc 2.10軟件對24個杏鮑菇供試菌株進行聚類分析，獲得各菌株間的聚類圖，見圖2。

圖2 杏鮑菇菌株的聚類分析圖

在相似系數(shù)0.850水平時，可將其余供試菌株分為5大類，第一類包括杏1、杏6和杏22;第二類包括杏2、杏4、杏5、杏8、杏9、杏房山1號、杏14、杏福建（蘭田）、杏10、杏11、杏20、杏21、杏16、杏18、杏19、杏13、杏17；第三類有杏23、杏24；第四類為杏3；第五類為杏7。這與本實驗室的栽培試驗獲得的杏3和杏7子實體形狀與其它菌株相差很大的結(jié)果是一致的。其中第二大類中共包括了17個菌株，在相似系數(shù)0.900水平時，又分為五小類，第一類包括杏2、杏4、杏5、杏8、杏9、杏房山1號；第二類包括杏10、杏11、杏20、杏21；第三類包括杏16、杏18、杏19；第四類只有杏13；第五類只有杏17。杏鮑菇菌株的主坐標分析見圖3。

圖3 杏鮑菇菌株的主坐標分析

對24份材料RAPD標記的原始矩陣進行主坐標分析，前3個主坐標的貢獻率分別為17.22%、15.49%和9.55%。從前3個主坐標的三維散點圖可以看出，主坐標分析和聚類分析所得結(jié)果基本一致。

3 結(jié)論與討論

筆者收集了北京地區(qū)24個杏鮑菇栽培品種，并對其基因組DNA進行RAPD擴增和進行遺傳多樣性分析。聚類分析結(jié)果表明，在相似系數(shù)為0.850的水平時，可將24個供試菌株分為5大類；主坐標分析結(jié)果與聚類分析基本一致。

RAPD技術(shù)是1990年由Welsh J和Williams JGK同時建立起來的操作簡便、靈敏快速、多態(tài)性好的遺傳標記[9]。近年來越來越多的研究者將其應用于食用菌類，如香菇、木耳、杏鮑菇等[4，10，11]的種間和種內(nèi)不同菌株的鑒定研究。劉曉紅等[8]應用該技術(shù)對國內(nèi)不同地區(qū)的杏鮑菇品種進行遺傳多樣性分析，將23個供試菌株分為五類，并且有一類菌株較多；分析表明該類菌株由于引種可能來源于同一地區(qū)，這與本研究獲得的結(jié)果一致，說明本研究收集到的北京地區(qū)的主要栽培品種的遺傳多樣性與全國范圍的品種多樣性一致。

此外，第二大類為生產(chǎn)中主要的栽培菌株，本研究結(jié)果表明這些菌株的遺傳差異性較小，說明很多菌株都是通過1個或2個優(yōu)良菌株通過雜交育種手段獲得。同時本研究結(jié)果還表明，RAPD技術(shù)能有效地把雜交菌株與親本菌株區(qū)分開來。

[1]Rodriguez Estrada AE,Jimenez Gasco MM,Royse DJ.Pleurotus eryngii species complex:Sequence analysis and phylogeny based on partial EF1α and RPB2 genes[J].Fungal Biol.,2010,114(5-6):421-428.

[2]Shibata T,Kudou M,Hoshi Y,et al.Isolation and characterization of a novel two-component hemolysin,erylysin A and B,from an edible mushroom,Pleurotus eryngii[J].Toxicon,2010,56(8):1436-1442.

[3]Jung HY,Bae IY,Lee S,et al.Effect of the degree of sulfation on the physicochemical and biological properties of Pleurotus eryngii polysaccharides[J].Food Hydrocolloid,2011,25(5):1291-1295.

[4]Ro HS,Kim SS,Ryu JS,et al.Comparative studies on the diversity of the edible mushroom Pleurotus eryngii:ITS sequence analysis,RAPD fingerprinting,and physiological characteristics[J].Mycol.Res.,2007,111(6):710-715.

[5]尚曉冬，宋春艷，沈?qū)W香，等.杏鮑菇菌株RAPD指紋圖譜分析[J].食用菌學報，2009，16(3)：1-4.

[6]劉曉紅，蔡為明，葉愛華，等.杏鮑菇種質(zhì)資源遺傳多樣性的RAPD分析[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2009，37(32)：15728-15729.

[7]許峰，劉宇，王守現(xiàn)，等.一種適于PCR反應的快速提取食用菌基因組DNA提取方法[J].生物技術(shù)，2011，21(2)：43-44.

[8]許峰，劉宇，王守現(xiàn)，等.北京地區(qū)白靈菇菌株的RAPD分析[J].生物技術(shù)，2010，38(15)：21-23.

[9]范英，鐘成剛，閆淑珍，等.竹黃菌基因組RAPD分子標記體系的建立[J].生物技術(shù)，2010，38(15)：23-26.

[10]Fu LZ,Zhang HY,Wu XQ,et al.Evaluation of genetic diversity in Lentinula edodes strains using RAPD,ISSR and SRAP markers[J].World J.Microb.Biotech.,2010,26(4):709-716.

[11]Yan PS,Luo XC,Zhou Q.RAPD molecular differentiation of the cultivated strains of the jelly mushrooms,Auricularia auricula and A.polytricha[J].World J Microb.Biotech.,2004,20(8):795-799.