康小虎，蔡亞?wèn)|，孫宜法，謝 放，任愛(ài)梅，孟憲剛

（蘭州交通大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院生物工程系，甘肅 蘭州 730070）

羊肚菌又名羊肚菜，是一種野生名貴食（藥）用真菌，因其菌蓋表面呈許多小凹坑，外觀極似羊肚而得名。尖頂羊肚菌（Morchella conica）是羊肚菌中非常重要的一類，其菌體內(nèi)含有多糖等活性成分，能增強(qiáng)人體的免疫功能，具有較強(qiáng)的抗衰老、抗腫瘤等作用[1，2]。我國(guó)羊肚菌分布廣泛,主要分布在甘肅、青海、四川、云南、黑龍江等地。甘肅羊肚菌資源主要分布在甘南州、天水、隴南、慶陽(yáng)等地，其中甘南藏族自治州山區(qū)尖頂羊肚菌分布較多，以尖頂羊肚菌（M.conica）、小羊肚菌（M.deliciosa）、小頂羊肚菌 （M.angusticeps）、粗柄羊肚菌 （M.crassipes）最為常見(jiàn)[3]。其中尖頂羊肚菌營(yíng)養(yǎng)豐富，氨基酸、礦物質(zhì)和微量元素種類齊全，含量豐富[4]，很有研究?jī)r(jià)值，但目前關(guān)于甘南州羊肚菌的研究開(kāi)發(fā)工作鮮見(jiàn)報(bào)道。另一方面，羊肚菌子實(shí)體的人工栽培是非常困難的，但所幸的是羊肚菌的菌絲體在營(yíng)養(yǎng)成分上與子實(shí)體相當(dāng)[5]，因此，研究羊肚菌菌絲體液體發(fā)酵培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)甘南州羊肚菌資源的開(kāi)發(fā)利用意義重大。本文研究了甘南藏族自治州尖頂羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的最優(yōu)培養(yǎng)基組分和最佳培養(yǎng)條件，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

采自甘肅省甘南州迭部縣的尖頂羊肚菌，由蘭州交通大學(xué)種苗工程研究所保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面種子培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯（去皮） 200 g·L-1、葡萄糖 20 g·L-1、瓊脂 18 g·L-1，自然 pH。

液體種子培養(yǎng)基：馬鈴薯（去皮） 100 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏 20 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1、維生素 B10.03 g·L-1，pH 7.0。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g·L-1、酵母浸膏10 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1、維生素 B10.03 g·L-1，pH7.0。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

氣浴恒溫培養(yǎng)箱、高壓蒸汽滅菌鍋、恒溫干燥箱、超凈工作臺(tái)、電子天平等。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化

斜面菌種接種于PDA平板上，25℃靜置避光培養(yǎng)4 d~5 d，菌絲可長(zhǎng)滿平板。

1.2.2 液體菌種培養(yǎng)

從活化好的羊肚菌PDA平板上用打孔器取得約1 cm2的菌絲體，接入到裝有100 mL液體種子培養(yǎng)基的三角瓶（250 mL） 中，置于25℃、100 r·min-1的搖床上避光培養(yǎng)4 d，即可作為液體發(fā)酵菌種備用。

1.2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

（1）碳源、氮源單因素篩選試驗(yàn)

碳源篩選實(shí)驗(yàn)：以2%的玉米粉、可溶性淀粉、蔗糖、白砂糖的替液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖作為碳源，其它組分和液體發(fā)酵培養(yǎng)基相同。接種量為10 mL，25℃、120 r·min-1搖瓶培養(yǎng)7 d。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)定菌絲體生物量。

氮源篩選實(shí)驗(yàn)：以1%的蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨代替液體發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母浸膏作為氮源，其它組分和搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基相同。接種量為10 mL，25℃、120 r·min-1條件下，搖瓶培養(yǎng)7 d。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，測(cè)定菌絲體生物量。

（2）無(wú)機(jī)鹽篩選實(shí)驗(yàn)

根據(jù)王小雄[4]對(duì)甘肅甘南州羊肚菌營(yíng)養(yǎng)成分分析和王新宇[6]對(duì)甘南州羊肚菌菌絲體生長(zhǎng)的研究，選取KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MnSO4以及CaCl2七種無(wú)機(jī)鹽，設(shè)計(jì)L8(27)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)方案見(jiàn)表1。

表1 無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)方案

（3）液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

根據(jù)碳源、氮源單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果和無(wú)機(jī)鹽正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以干菌絲體得率為考量指標(biāo)，綜合考慮原料來(lái)源和價(jià)格因素，選擇影響羊肚菌干菌絲體得率的主因素。碳源為白砂糖，氮源為豆粕粉，無(wú)機(jī)鹽為 MgSO4·7H2O和KH2PO4。另外，任桂梅[7]等的研究認(rèn)為維生素B1作為生長(zhǎng)因子對(duì)食用菌菌絲體的生長(zhǎng)影響明顯，故將維生素B1作為生長(zhǎng)因子，設(shè)計(jì)L16(45)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)方案見(jiàn)表2。

表2 發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn)方案

1.2.4 液體搖瓶發(fā)酵條件的優(yōu)化

在最佳發(fā)酵培養(yǎng)基成分的基礎(chǔ)上，以不同溫度、初始pH值、接種量、培養(yǎng)時(shí)間和轉(zhuǎn)速，設(shè)計(jì)L16(45)正交試驗(yàn)，以干菌絲體得率為指標(biāo)，確定最佳發(fā)酵條件，試驗(yàn)方案見(jiàn)表3。

表3 液體發(fā)酵條件正交試驗(yàn)方案

1.2.5 干菌絲體得率的計(jì)算

發(fā)酵液用紗布過(guò)濾，所得菌絲球用去離子水清洗3次~5次，置于80℃烘箱中干燥2 h至恒重，計(jì)算干菌絲體得率。干菌絲體得率（P，g·L-1）公式為：

式中：m為干菌絲體質(zhì)量（g）；v為發(fā)酵液體積（L）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源、氮源的單因素篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

2.1.1 碳源篩選實(shí)驗(yàn)

在不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，培養(yǎng)7 d后，菌絲體呈現(xiàn)微黃色的菌球，直徑為5 mm~15 mm不等，不同碳源生長(zhǎng)條件下獲得的干菌絲體得率的差異如圖1所示。

由圖1中可看出，所選碳源均能培養(yǎng)產(chǎn)生菌絲體。蔗糖、葡萄糖和白砂糖作為碳源獲得的干菌絲體是相對(duì)較高的，分別為 6.86 g·L-1、6.55 g·L-1、6.67 g·L-1，三者之間無(wú)明顯差異，其主要原因是它們都屬于速效碳源，培養(yǎng)初期（5 d前）菌絲體生長(zhǎng)很好，但是以葡萄糖為碳源時(shí)，在培養(yǎng)后期（5 d后）菌絲體的自溶現(xiàn)象是最明顯的。其次是玉米粉（5.12 g·L-1），可溶性淀粉最低（3.94 g·L-1）。綜合菌絲體得率、碳源來(lái)源、價(jià)格等因素考慮，選擇白砂糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基碳源。

2.1.2 不同氮源生長(zhǎng)條件下獲得的干菌絲體得率情況

不同氮源生長(zhǎng)條件下所獲得的干菌絲體得率，其差異情況見(jiàn)圖2。

圖1 不同碳源對(duì)干菌絲體得率的影響

所選氮源均能產(chǎn)生一定量的菌絲體。蛋白胨、酵母浸膏和豆粕粉為氮源獲得的干菌絲體得率較高，分別是7.63 g·L－1、8.02 g·L－1、7.95 g·L－1，三者之間差異不大，其次是硫酸銨（6.70 g·L－1），氯化銨（5.63 g·L－1）最低。分析原因可能是前三者均屬?gòu)?fù)合型氮源，其中含有羊肚菌生長(zhǎng)因子和微量元素，菌絲體的生長(zhǎng)速率較快。綜合考慮不同氮源干菌絲體得率、原料來(lái)源、使用成本等因素，選擇豆粕粉為液體發(fā)酵培養(yǎng)基氮源。

圖2 不同氮源對(duì)羊肚菌干菌絲得率的影響

2.2 無(wú)機(jī)鹽篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

選取 KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、ZnSO4、MnSO4、CaCl2七種無(wú)機(jī)鹽，每種無(wú)機(jī)鹽設(shè)2水平，設(shè)計(jì)L8(27)正交試驗(yàn)，試驗(yàn)方案和結(jié)果見(jiàn)表4。

以干菌絲體得率為考察指標(biāo)，極差分析顯示無(wú)機(jī)鹽對(duì)干菌絲體得率影響主次關(guān)系 A（KH2PO4）=C（MgSO4·7H2O）＞G（CaCl2）＞B（K2HPO4）＞D（ZnSO4）＞E（FeSO4·7H2O）＞F（MnSO4），其中KH2PO4和MgSO4·7H2O極差值最大，說(shuō)明這兩種無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌絲體生長(zhǎng)量影響最大，因此選取這兩種無(wú)機(jī)鹽為發(fā)酵培養(yǎng)基組分。

表4 無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

根據(jù)碳源、氮源單因素試驗(yàn)結(jié)果和無(wú)機(jī)鹽正交試驗(yàn)結(jié)果，以干菌絲體得率為考量指標(biāo)，設(shè)計(jì)L16(45)正交試驗(yàn)。試驗(yàn)因素包括碳源白砂糖、氮源豆粕粉、無(wú)機(jī)鹽KH2PO4和MgSO4·7H2O，生長(zhǎng)因子維生素B1，每因素設(shè)四水平，試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表5。

從表中極差值R可以得到發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳水平組合A3B3C3D2E3，即白砂糖 30 g·L－1、豆粕粉 15 g·L－1、KH2PO40.75 g·L－1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L－1、維生素 B10.03 g·L－1。

2.4 液體發(fā)酵條件的優(yōu)化

采用優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)不同溫度、初始pH值、接種量、轉(zhuǎn)速和培養(yǎng)時(shí)間5個(gè)因素，每因素四水平，設(shè)計(jì)L16(45)正交試驗(yàn)，以干菌絲體得率為考量指標(biāo)、確定最佳發(fā)酵條件，實(shí)驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表6。

極差分析結(jié)果顯示最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)條件組合為A3E4B3C2D2，即最佳液體發(fā)酵條件為溫度30℃，培養(yǎng)液初始 pH7，接種量 10 mL，轉(zhuǎn)速 120 r·min－1，培養(yǎng)時(shí)間為 8 d。

3 結(jié)論

本文通過(guò)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)對(duì)甘南州尖頂羊肚菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。確定的最佳培養(yǎng)基配比為白砂糖 30 g·L－1、豆粕粉 15 g·L－1、KH2PO40.75 g·L－1、MgSO4·7H200.5 g·L－1、維生素 B10.03 g·L－1。液體搖瓶發(fā)酵的最優(yōu)條件為溫度30℃，培養(yǎng)液初始pH7，接種量10 mL，轉(zhuǎn)速 120 r·min－1，培養(yǎng)時(shí)間 8 d。

[1]張松.食用菌學(xué)[M].廣東：華南理工大學(xué)出版社，2000.

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[3]杜品.甘南州林區(qū)的大型藥用真菌[J].中國(guó)食用菌，1999，19(1)：19－20.

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表5 液體發(fā)酵培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

[5]趙桂云，馬慶斌.羊肚菌液體培養(yǎng)基配方的研究[J].食用菌，2002(6)：15-16.

[6]王新宇，梁祖炳，蒲訓(xùn).三種不同羊肚菌菌絲體的生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)合成和酯酶同功酶的組成[J].真菌學(xué)報(bào)，1996，15(3)：220-226.

表6 液體發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果及分析

[7]任桂梅，周茂林，毋楠.維生素B1對(duì)幾種擔(dān)子菌菌絲體生長(zhǎng)的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(26)：8075-8076.