王甲威，林 科，姜 超，魏海蓉，劉慶忠*

（1.山東省果樹研究所，山東省果樹生物技術(shù)育種重點實驗室，山東 泰安 271000；2.泰山學(xué)院生物與釀酒工程學(xué)院，山東 泰安 271021）

CBF基因（又稱DREB1基因），編碼一個具有AP2-domain的轉(zhuǎn)錄激活子，能夠結(jié)合到DNA上具有 CRT（C-repeat）或 DRE（Dehydration-responsive element）調(diào)節(jié)位點的位置，調(diào)節(jié)植物冷適應(yīng)相關(guān)基因表達[1]。CBF基因是植物冷適應(yīng)及信號傳導(dǎo)領(lǐng)域最有意義的發(fā)現(xiàn)之一，在多種重要農(nóng)作物及蔬菜中均發(fā)現(xiàn)該基因，進一步研究發(fā)現(xiàn)，多種與植物冷適應(yīng)相關(guān)的基因都受其調(diào)控[2-4]。國外學(xué)者在高叢越橘（Highbush blueberry，Vaccinium corymbosum）和兔眼越橘（Rabbiteye blueberry，Vaccinium virgatum）中也克隆到越橘的CBF基因，通過試驗驗證其功能，研究發(fā)現(xiàn)CBF基因表達量和表達模式的差異可能與高叢越橘品種藍豐（Bluecrop）和兔眼越橘品種梯芙藍（Tifblue）的抗寒性不同相關(guān)[5]。

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）是指在基因組水平上由單核苷酸變異所引起的一種序列多態(tài)性[6]。在所有可能的DNA序列差異性中，單核苷酸多態(tài)性是發(fā)生頻率最高的變異。在人類的DNA序列多態(tài)性中，90%序列多態(tài)性都是單核苷酸多態(tài)性[7]。單核苷酸多態(tài)性具有數(shù)量大、分布廣、穩(wěn)定性強、易于分型等優(yōu)點，在人類疾病診斷及治療、致病基因的發(fā)現(xiàn)、族群演化研究等方面起重要作用，同時在小麥、玉米、大豆等作物的物理作圖、進化研究、遺傳研究中也是很有效的分子標(biāo)記[6,8-13]。

本研究以16個抗寒性不同的高叢越橘品種為試材，克隆其CBF基因，采用直接測序法篩查VcCBF基因的單核苷酸多態(tài)性，以期為研究VcCBF基因與越橘抗寒性的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 高叢越橘品種

研究采用的16個高叢越橘品種采自山東省果樹研究所越橘品種資源圃，分別為北陸（Northland）、喜來（Sierra）、陶柔（Toro）、都克（Duke）、日出（Sunrise）、藍豐（Bluecrop）、埃利奧特（Elliott）、達柔（Darrow）、藍塔（Bluetta)、澤西（Jersey）、布里吉塔（Brigitta）、早藍（Earliblue）、晚藍（Lateblue）、藍金（Bluegold）、瑞卡（Reka）和普魯（Puru）。

1.2 VcCBF基因的克隆、測序及單核苷酸多態(tài)性分析

以越橘幼嫩葉片為試材，采用TIANGEN植物基因組提取試劑盒提取基因組DNA，根據(jù)已發(fā)表越橘CBF基因序列設(shè)計引物，進行PCR擴增，擴增所用的上游引物為5'GAATCGTCGATGGAATATA ACT 3'，下游引物為5'TCTAAAATCTAACTCCACA ACG 3'，PCR產(chǎn)物回收后采用pMD18-T Vector載體（TaKaRa公司）連接，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，LB/Amp平板上培養(yǎng)過夜后挑取菌落進行菌落PCR篩選陽性克隆，陽性克隆測序由上海生工生物技術(shù)有限公司完成[14]。每個品種測序8個陽性克隆，所得序列采用DnaSP v5分析VcCBF基因的單核苷酸多態(tài)性[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 VcCBF基因的克隆

PCR所得目的片段長度為698 bp，PCR產(chǎn)物回收后連接轉(zhuǎn)化，將陽性克隆進行測序，對測序結(jié)果進行序列比對，除去重復(fù)序列，每個越橘品種得到4～8個序列，共得到94個非重復(fù)序列（見表1）。

表1 16個高叢越橘品種測序得到的VcCBF基因非重復(fù)序列Table1 Non repetitive sequences of VcCBF gene in 16 highbush blueberry cultivars

2.2 VcCBF基因的單核苷酸多態(tài)性

將所得VcCBF基因編碼區(qū)（全長681 bp）的94個非重復(fù)序列利用DnaSP軟件進行單核苷酸多態(tài)性分析，共發(fā)現(xiàn)103個SNP，全部為單核苷酸的替換，并沒有InDel情況發(fā)生，SNP發(fā)生頻率為1/619 bp，核苷酸多態(tài)性值（Pi）為0.01274。在103個SNP中，單態(tài)突變位點（Singleton variable sites）52個，簡約信息位點（Parsimony informative sites）51個，在簡約信息位點中，雙突變?yōu)?0個，三突變?yōu)?個（見表2）。

表2 16個高叢越橘品種VcCBF基因的單核苷酸多態(tài)性類型Table2 SNPs type of VcCBF gene in 16 highbush blueberry cultivars

進一步對VcCBF基因單核苷酸多態(tài)性堿基替換方式進行分析（見表3），除去三突變的簡約信息位點后，在剩余的102個SNP中，轉(zhuǎn)換（A?G，T?C）共有83個，顛換（G?T，A?C，C?G，A?T）共有19個，轉(zhuǎn)換與顛換的比率為4.37∶1。

2.3 VcCBF基因的單倍型分析

對來自同一品種不同克隆的非重復(fù)序列進行組裝，得到一致序列。利用DNAStar Megalign軟件分別對來自不同材料的序列進行多序列聯(lián)配，分析其單倍型，結(jié)果見圖1。組裝得到一致序列后，通過序列聯(lián)配，這16個越橘品種可分為5種單倍型（Haplotype），且不同品種的越橘單倍型差異較大。

表3 VcCBF基因的堿基替換方式Table3 Substitution types of bases in SNPs

圖1 16個高叢越橘品種VcCBF基因的單倍型關(guān)系Fig.1 VcCBF gene haplotype of 16 highbush blueberry cultivars

3 討論與結(jié)論

檢測單核苷酸多態(tài)性的方法很多，直接測序法是篩查SNP最可靠的方法之一，特別是對基因組信息較少、分子生物學(xué)研究較少的物種而言。本研究通過對16個越橘品種VcCBF基因的克隆測序，得到94個非重復(fù)序列，測序總長度63 732 bp，在VcCBF基因的編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)103個多態(tài)性位點，單核苷酸多態(tài)性發(fā)生頻率為1/619 bp，核苷酸多態(tài)性值（Pi）為0.01274，相對于其他物種，VcCBF基因單核苷酸多態(tài)性頻率較低，這可能與其受到的選擇壓力較大相關(guān)。通過對103個SNP的具體分析，發(fā)現(xiàn)單態(tài)突變位點52個，簡約信息位點51個（其中雙突變50個，三態(tài)突變1個），在堿基轉(zhuǎn)換方式分析中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)換共有83個，顛換為19個，轉(zhuǎn)換與顛換的比率為4.37∶1。通過進一步組裝一致序列，進行單倍型分析，在16個越橘品種中共有5種單倍型。

直接測序法篩查SNP也存在不足，首先在克隆和測序過程中會造成假陽性，在檢測到的52個單態(tài)突變位點中可能存在克隆或測序錯誤造成的誤差。此外，高叢越橘品種為四倍體，且多為雜交選育而來，其本身VcCBF基因的情況較為復(fù)雜，本研究從每個品種篩選8個陽性克隆進行測序，可能造成其內(nèi)源VcCBF基因的缺失，從而對分析其單核苷酸多態(tài)性和單倍型造成不足，這也是多倍體植物中單核苷酸多態(tài)性開發(fā)的難點之一[16]。多倍體植物中單核苷酸多態(tài)性開發(fā)的另外一個難點就是區(qū)分品種內(nèi)的多態(tài)性和品種間的多態(tài)性，如普通小麥（異源六倍體），以26個品系為材料，采用直接測序法篩查其21個基因的SNP，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大部分的SNP是品種內(nèi)的多態(tài)性，品種間的多態(tài)性數(shù)量較少[17]。

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