紀(jì)春艷，任榮，柴軍紅，李然紅，王立鳳

（牡丹江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江157012）

白蘚 （DictamnusdasycarpusTurcz.）為蕓香科白蘚屬的多年生宿根草本植物。白蘚根皮可供藥用，具有祛風(fēng)化濕、止癢、清熱解毒之功效。［2－3］目前對(duì)白蘚根皮的成分、藥理等已有一定的研究，但對(duì)白蘚莖葉和種殼的研究報(bào)道很少。筆者分別以白蘚莖葉和種殼為材料，采用95%的乙醇水溶液提取，提取液經(jīng)石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取并對(duì)其萃取物的抑菌活性進(jìn)行了研究，通過抑菌活性部位追蹤，以期為尋找新的具有抑菌活性的中藥資源提供理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 試驗(yàn)樣品

白蘚全草采集于牡丹江市鏡泊湖熔巖地區(qū)，經(jīng)鑒定為蕓香科白蘚屬植物。

1.2 供試菌種

大腸桿菌 （Escherichiacoli），金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus），普通變形桿菌（Proteusvulgaris），枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis）均由牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基

LB（Luria－Bertani）固體培養(yǎng)基：45g營(yíng)養(yǎng)瓊脂加1000mL蒸餾水煮沸后定容。于121℃滅菌20min。

LB液體培養(yǎng)基：牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、蒸餾水1000mL、調(diào)pH7.2～7.4于121℃滅菌20min［4］。

1.4 儀器與試劑

1.4.1 儀器。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮 RE－52AA），SHB－3循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠），真空干燥箱（沈陽(yáng)林頻設(shè)備實(shí)驗(yàn)公司），電子天平（上海分析儀器廠），高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠），超凈工作臺(tái)（蘇州潔凈技術(shù)研究所制造），電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京科偉醫(yī)療器廠），架盤天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）等。

1.4.2 試劑。二甲基亞砜DMSO，由天津市化學(xué)試劑一廠生產(chǎn)；頭孢氨芐霉素（批號(hào)：20100209），由哈藥集團(tuán)三精制藥四廠生產(chǎn)；丙酮、氯仿、乙酸乙酯、甲醇和正丁醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 白蘚莖葉提取液的制備

采用溶劑冷浸法：將采集的白蘚全草清洗干凈、陰處曬干，挑選出其中的莖葉，粉碎、過篩。準(zhǔn)確稱取313g干粉，放入錐形瓶中，按料液比1∶5加入95%的乙醇水溶液，然后于室溫下浸提24h，浸提過程每隔2h攪拌一次，抽濾。重復(fù)3次，將濾液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至無(wú)乙醇味，得濃縮液A0為450mL。密封保存于4℃冰箱中備用。

2.2 白蘚莖葉不同溶劑提取物的制備

采用液－液萃取法：將提取的濃縮液依次用等體積的石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取，每種溶劑萃取3次，合并3次萃取液，減壓濃縮至蒸干溶劑，分別獲得石油醚萃取相（A1）、氯仿萃取相（A2）、乙酸乙酯萃取相（A3）、正丁醇萃取相（A4）和水萃取相（A5）。

2.3 白蘚種殼提取液的制備

采用溶劑冷浸法：挑選出陰干的白蘚種殼，將其粉碎、過篩。準(zhǔn)確稱取235g種殼干粉，放入錐形瓶中，其浸提方法同白蘚莖葉。最后得濃縮液B0為250mL。密封保存于4℃冰箱中備用。

2.4 白蘚種殼不同溶劑提取物的制備

采用液－液萃取法：方法同2.2。最終獲得白蘚種殼石油醚萃取相（B1）、氯仿萃取相（B2）、乙酸乙酯萃取相（B3）、正丁醇萃取相（B4）和水萃取相（B5）。

2.5 樣品的制備

準(zhǔn)確稱取 A2、A3、A5、B2、B3、B5，分別溶于 DMSO中配制成25mg／mL的溶液。頭孢氨芐霉素（T）配制成10mg／mL作為陽(yáng)性對(duì)照。每種樣品經(jīng)微孔濾膜（孔徑0.22μm）過濾滅菌后待用。A1、A4、B1、B4萃取物質(zhì)量太少，因此未被選用。

2.6 菌液的制備

在無(wú)菌室中將供試菌種移接入相對(duì)應(yīng)的試管斜面培養(yǎng)基上，進(jìn)行活化，細(xì)菌置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用無(wú)菌水配制成1×107～1×108CFU／mL的菌液。

2.7 體外抑菌試驗(yàn) （濾紙片法）［5］

用打孔器將濾紙打成直徑為10mm的圓紙片，121℃滅菌30min，在每種待測(cè)樣品中浸入無(wú)菌濾紙片，充分浸泡后取出、晾干。在超凈工作臺(tái)上將滅菌后的固體培養(yǎng)基倒入無(wú)菌培養(yǎng)皿中，每皿20mL左右。待冷卻凝固后，加入制備好的菌懸液各0.1mL用涂布棒將菌液涂布均勻。用無(wú)菌鑷子夾取含樣品液的濾紙片貼在培養(yǎng)基表面。每皿貼3片，每個(gè)菌種3次重復(fù)，放在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，用游標(biāo)卡尺測(cè)定其抑菌圈直徑，取3個(gè)平行的平均值。以DMSO做為空白對(duì)照。

2.8 最低抑菌濃度（M IC值）的測(cè)定［6］

以A2為例：在無(wú)菌條件下將滅菌試管分成4組，每組9支。向每組的第1支試管中加入2mL 2倍濃度的LB液體培養(yǎng)基，第2～7支試管中各加入2mL LB液體培養(yǎng)基；向每組的第1支試管中加入2mL A1樣品液，混勻后吸出2mL加至第2號(hào)試管中，如此稀釋至第7管，從第7管中吸出2mL棄去，使各管藥液濃度分別為5.00、2.50、1.25、0.63、0.31、0.16、0.078mg／mL，然后，向各管中加入0.1mL的菌液，第8支試管中加入2mL LB液體培養(yǎng)基不加樣品液作為陽(yáng)性對(duì)照，第9支試管中加入提取液但不加菌懸液作為陰性對(duì)照，于37℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌效果。試驗(yàn)重復(fù)3次。液體培養(yǎng)基透明為無(wú)菌生長(zhǎng)，混濁為有菌生長(zhǎng)。以無(wú)菌生長(zhǎng)的最低樣品液濃度作為最低抑菌濃度（MIC）。對(duì)不宜判定有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)者，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線接種，37℃恒溫培養(yǎng)24h后取出，以完全無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的平板所對(duì)應(yīng)的樣品液濃度作為此樣品液對(duì)該菌株的最小抑菌濃度（MIC）。其余樣品操作方法如A2。

3 結(jié)果與分析

3.1 濾紙片法測(cè)定白蘚莖葉及種殼粗提物的抑菌作用

按照“2.7”操作，結(jié)果見表1。從表1可知，各提取液對(duì)變形桿菌抑菌作用較小，對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、大腸桿菌均具有一定的抑菌作用。A2的抑菌圈直徑：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草桿菌，變形桿菌無(wú)抑菌效果。A3的抑菌圈直徑：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞變形桿菌＞枯草桿菌。B2的抑菌圈直徑：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞變形桿菌＞枯草桿菌。B3的抑菌圈直徑：金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草桿菌，對(duì)變形桿菌無(wú)抑菌效果。其中金黃色葡萄球菌、枯草桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，大腸桿菌、變形桿菌為革蘭氏陰性菌。

A2、A3、B2、B3的抑菌結(jié)果趨勢(shì)基本一致，且四者對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌作用較變形桿菌和枯草桿菌的抑菌作用強(qiáng)。

表1 白蘚莖葉及種殼氯仿相乙酸乙酯相濾紙片法的抑菌結(jié)果

3.2 白蘚莖葉及種殼各萃取相對(duì)供試菌的最低抑菌濃度

由表2可知：A2對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度相同，均為3.13mg／mL，且對(duì)變形桿菌無(wú)抑菌效果；A3對(duì)大腸桿菌、變形桿菌、枯草桿菌的最小抑菌濃度均為3.13mg／mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，其最小抑菌濃度為1.57mg／mL。B2對(duì)供試菌的最小抑菌濃度分別是金葡菌1.57mg／mL、大腸桿菌1.57mg／mL 、枯草桿菌3.13 mg／mL、變形桿菌3.13mg／mL。B3對(duì)供試菌的最小抑菌濃度分別：金葡菌1.57mg／mL、大腸桿菌1.57mg／mL、枯草桿菌3.13mg／mL，且對(duì)變形桿菌無(wú)抑菌效果。其中金黃色葡萄球菌、枯草桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，大腸桿菌、變形桿菌為革蘭氏陰性菌。

陽(yáng)性對(duì)照均沒有抑菌活性，陰性對(duì)照均為無(wú)菌生長(zhǎng)。符合抑菌實(shí)驗(yàn)要求。

表2 白蘚莖葉及種殼粗提物對(duì)供試菌的最小抑菌濃度

4 結(jié)論與討論

分別對(duì)白蘚莖葉及種殼粗提物的氯仿相（A2及B2）和乙酸乙酯相（A3及B3）提取物做了抑菌實(shí)驗(yàn)和最小抑菌濃度實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)結(jié)果表明：氯仿相和乙酸乙酯相對(duì)四種菌都具有不同程度的抑菌效果，但抑菌效果不同。A2、A3、B2、B3對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌顯示了較好的抑菌效果，對(duì)枯草桿菌也表現(xiàn)出了一定的抑制活性。此外，白蘚莖葉及種殼對(duì)大腸桿菌的抑制作用主要表現(xiàn)在其中等強(qiáng)度的極性部位乙酸乙酯萃取相。A2和B3對(duì)變形桿菌無(wú)抑菌效果，可能是由于量較低，在該試驗(yàn)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)尚不足以較好的抑制變形桿菌增殖。

該研究對(duì)牡丹江鏡泊湖火山熔巖地區(qū)的白蘚植物進(jìn)行了探索研究，初步揭示了白蘚對(duì)4種常見菌種的有效抑菌部位。這為今后對(duì)其抑菌活性成分的進(jìn)一步分離與分析奠定了基礎(chǔ)，預(yù)示其具有作為抑菌活性劑進(jìn)行開發(fā)的價(jià)值。

［1］ 《全國(guó)中草藥匯編》編寫組.全國(guó)中草藥匯編（上冊(cè)）［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1988.

［2］ 《中醫(yī)辭典》編輯委員會(huì).簡(jiǎn)明中醫(yī)辭典［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1980.

［3］ 嚴(yán)仲鎧，李萬(wàn)林.中國(guó)長(zhǎng)白山藥用植物彩色圖志［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1997.

［4］ 黃秀梨.微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.北京：高等教育出版社，2004（8）：6－8.

［5］ 段江蓮，徐建國(guó).桑椹紅色素抑菌作用的研究［J］.食品科學(xué)，2007，28（10）：87－89.

［6］ 李芳.復(fù)方蕓香片的體外抑菌作用實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2001，12（11）：971－972.