張帥，王金鳳，馬永強

（哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，哈爾濱150076）

細菌素（bacteriocin）是由細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，主要含有具生物活性的蛋白質(zhì)部分，對同種近緣菌株呈現(xiàn)狹窄的活性抑制譜［1］。由于細菌素可被人體消化道中的一些蛋白酶（如胰蛋白酶）所降解，不會在體內(nèi)蓄積而引起不良作用。而且其具有熱穩(wěn)定性，并耐酸、耐低溫貯藏［2］；對食品的口感、味等無不良影響；它的使用可以減弱殺菌強度，減少殺菌時間，有利于保持食品原有的營養(yǎng)價值和風(fēng)味。

隨著社會進步和全民食品健康、安全意識的增強，廣大消費者越來越關(guān)心食品的安全性問題。在歐洲、日本等國家微生態(tài)制劑，引起高效性和安全性受到廣泛矚目?？茖W(xué)工作者已就細菌素的穩(wěn)定性及生理生化等方面進行了較為深入的研究。研究結(jié)果顯示，細菌素不但具有抗細菌、抗真菌的作用，還具有抗寄生蟲等方面的功能，在食品保鮮方面，可望成為替代某些化學(xué)合成抑菌劑的物質(zhì)［3］。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillusacidophilus）是天然存在于人和動物的胃腸道的益生菌，屬于乳桿菌科乳桿菌屬（Lactobacillus），對維持胃腸道的生理功能有重要作用［4］。通過對嗜酸乳桿菌中細菌素的分離純化的研究，為食品的保鮮材料提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

嗜酸乳桿菌（L.acidophilus，分離自開菲爾粒）

指示菌株：德氏乳桿菌（L.delbrueckiisubsp.lac－tis，DSM 20076，S＋）

本研究使用的凍藏菌株使用前活化2次，使用MRS肉湯培養(yǎng)基（接種量2%），37℃培養(yǎng)24h。

瓊脂平板培養(yǎng)基：瓊脂粉1.5%（w／v）。

軟瓊脂培養(yǎng)基：向肉湯培養(yǎng)基中加入瓊脂粉0.75%（w／v）。

產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基：MRS肉湯培養(yǎng)基配方中用油酸替代 Tween 80，油酸用量為0.1%（v／v）。

1.2 實驗儀器

恒溫培養(yǎng)箱，1L磁力攪拌玻璃發(fā)酵罐，大容量低溫離心機，層析柱，自動部分收集器，紫外檢測器，0.45μm醋酸纖維素濾膜。

1.3 實驗方法

1.3.1 嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)

1.3.1.1 生長曲線與細菌素活力曲線

嗜酸乳桿菌（L.acidophilus）首先被活化2次，然后分別在MRS和產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基中培養(yǎng)。向1L液體發(fā)酵罐中加入750mL需要的培養(yǎng)基，接種量2%，培養(yǎng)溫度37℃，振蕩速率150r／min。體系pH通過pH控制裝置流加12%氨水來使之恒定為pH6.0。每次取10mL樣品進行分析，根據(jù)24h內(nèi)的不同培養(yǎng)時間對細胞數(shù)（菌液的OD值）和細菌素活性作圖。

1.3.1.2 細菌素的發(fā)酵

L.acidophilus首先被活化2次，然后分別在MRS和產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基中培養(yǎng)。向1L液體發(fā)酵罐中加入750mL需要的培養(yǎng)基，接種量2%，培養(yǎng)溫度37℃，振蕩速率150r／min。體系pH通過pH控制裝置流加12%氨水來使之恒定為pH6.0。培養(yǎng)16h后，用鹽酸調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH5.0，然后離心除去細胞（4000×g，10min），上清液冷藏于－20℃，以備細菌素檢測和分離純化［5］。

1.3.2 細菌素活性檢測

培養(yǎng)液的細菌素活性檢測采用抑菌圈法，MRS瓊脂培養(yǎng)基，德氏乳桿菌（L.delbrueckii）為指示菌株。

指示菌株制備：向5mL軟MRS瓊脂培養(yǎng)基中加入經(jīng)10倍稀釋，并放置過夜的指示菌L.delbrueckii培養(yǎng)液0.125mL。試管內(nèi)容物混合均勻，傾倒在預(yù)先鋪好的MRS瓊脂平板上。細菌素樣品使之通過0.45μm醋酸纖維素濾膜達到滅菌作用。

活性的測定采用臨界稀釋法，通過連續(xù)兩倍稀釋的培養(yǎng)液來檢驗指示菌的生長狀況?；钚酝ㄟ^能產(chǎn)生明顯透明區(qū)的最大稀釋度的倒數(shù)來表示，活性單位（AU）每毫升培養(yǎng)液。測定結(jié)果通過下式計算：C＝（1000／d）×D，C是細菌素溶液濃度 AU／mL，D是稀釋倍數(shù)，d是試樣量（即每點取用的細菌素溶液量）。

1.3.3 細菌素的鹽析分離

嗜酸乳桿菌在pH6.0的產(chǎn)細菌素培養(yǎng)基中恒溫培養(yǎng)，離心分離細胞，上清液在4℃下用新華一號濾紙過濾，以使油酸與細菌素分離。存在于上清液相中的細菌素采用硫酸銨鹽析法（400g／L）粗分離，硫酸銨與上清液混合物在4℃下冰箱內(nèi)靜置過夜，離心（8000×g，30min）分離沉淀物。收集的沉淀物然后再復(fù)溶于0.05M醋酸鈉緩沖液（pH5.0）中，4℃下用截留分子量為1kDa的膜對相同的緩沖液透析過夜，得組分Ⅰ。

1.3.4 細菌素的純化

采用 carboxymethyl（CM）－Sepharose 柱 （2cm×8.5cm），用0.05MpH5.0乙酸鈉緩沖液平衡，平衡液流速1mL／min。待組分Ⅰ上樣后，用0.073M pH5.0乙酸鈉緩沖液洗脫，至在280nm波長處無吸收檢出。

細菌素的純化采用梯度洗脫（0.073MpH5.0乙酸鈉緩沖液中溶有0～0.6MNaCl）。取3mL洗脫組分進行抗微生物檢驗。收集具有活性的組分，對20mM磷酸鈉緩沖液（pH5.8）透析得組分Ⅱ。

向組分Ⅱ中加入硫酸銨，至終濃度達10%，隨后用為含10% 硫酸銨20mM磷酸鈉緩沖液（pH5.8）平衡的octyl－Sepharose CL－4B柱（1cm×6.5cm）進行分離。用平衡緩沖液洗后，細菌素用含20mM磷酸鈉緩沖液（pH5.8）的50%乙醇洗脫。收集具有活性的組分，冷凍干燥得組分Ⅲ。

1.3.5 表面活性劑對細菌素活性的影響

在細菌素發(fā)酵過程中，向培養(yǎng)基中加入下列表面活性劑：吐溫Tween 20，Tween 80，Triton X－100，乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P－40），SDS，尿素，溴化十六烷基－三甲基胺 （hexadecyl－trimethylammonium bromide），N－月桂酰肌氨酸（N－lauroylsarcosine）和β－巰基乙醇（β－mercaptoethanol），所有的表面活性劑的最后濃度均為1%。為了減少二硫鍵還原對細菌素活性的影響，細菌素檢驗中加入二硫蘇糖醇（DTT，終濃度1mM）。對照由細菌素和表面活性劑及50mM磷酸鈉緩沖液（pH7.0）組成。所有樣品及對照均在37℃預(yù)熱6h，然后測定細菌素濃度。

為了觀察Tween 80的效果，培養(yǎng)過程中不加Tween 80，發(fā)酵后離心去除細胞后的培養(yǎng)基質(zhì)經(jīng)4℃過濾去除油酸后，加入Tween 80，濃度分別為0、0.05、0.10、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.5（v／v）。然后樣品及對照在37℃預(yù)熱6h，然后測定細菌素活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌的生長曲線與細菌素活力曲線

圖1 嗜酸乳桿菌生長曲線

圖2 細菌素活性變化曲線

由圖1和圖2可以看出，在嗜酸乳桿菌的培養(yǎng)過程中，在8h后，開始進入對數(shù)生長期，而在對數(shù)生長期的后期穩(wěn)定期開始時，開始出現(xiàn)細菌素抑菌活性的高峰，具體時間是在16h左右達到最大的抑菌活性而且會持續(xù)到24h。在相關(guān)研究中，發(fā)現(xiàn)如果去除培養(yǎng)基中的Tween 80等表面活性劑或油酸，嗜酸乳桿菌的產(chǎn)細菌素能力會大大下降，有的研究者稱其原因是這些物質(zhì)除具有乳酸菌生長促進劑的作用外，其乳化特性可能還會影響微生物細胞產(chǎn)生的親水性或疏水性小肽的生物活性。

2.2 細菌素的純化

表1 細菌素的純化進程表

細菌素的純化程序包括3個步驟：硫酸銨沉淀、離子交換色譜（IEC）和疏水作用色譜（HIC）。純化進程如表1。由上表可以看到該純化程序是有效的，但是在IEC和HIC之間，純化倍數(shù)較低。結(jié)合其他研究者的相關(guān)論述，該細菌素的水溶性應(yīng)該是較低的，這也從另一個角度提示，Tween 80能夠促進其抑菌活性，應(yīng)該與提高了其在溶液相中的分散性有關(guān)。此外有些研究者報告了采用電泳方法進行進一步分離失敗的情況，證實了其在水為媒介的緩沖液中的溶解能力極低。

2.3 表面活性劑對細菌素活性的影響

由表2的結(jié)果可以得出這樣的結(jié)論，陰離子表面活性劑如SDS，是通過與蛋白天然結(jié)構(gòu)中的內(nèi)部疏水區(qū)的配位作用使得蛋白結(jié)構(gòu)被打開，從而影響蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。在這種情況下，加入兩種陰離子表面活性劑中的任何一種（SDS和N－月桂酰肌氨酸）都會使抑菌能力提高；非離子表面活性劑的作用則因化合物而異，Triton X－100和 Nonidet P－40可以提高其抑菌能力，而Tween20不會對抑菌作用產(chǎn)生影響，Tween 80甚至使抑菌能力下降；陽離子表面活性劑對抑菌活性的影響也各不相同，溴化十六烷基－三甲基胺能使抑菌能力大幅度提高，β－巰基乙醇也會使抑菌能力顯著降低，但是加入DTT和尿素卻觀察不到細菌素活性的明顯變化。DTT存在情況下對細菌素活性沒有影響這一事實說明，在其分子中不存在二硫鍵，這與某些研究者在細菌素氨基酸構(gòu)造成的報告中，關(guān)于不存在胱氨酸的結(jié)論是一致的。而溴化十六烷基三甲胺陽離子的作用應(yīng)該是極特殊的例證，已經(jīng)不能簡單用表面活性劑的非特異性的影響來解釋了。

研究還發(fā)現(xiàn)Tween80使細菌素活性降低的程度是具有濃度依賴關(guān)系的。當加入的Tween80的濃度在一定范圍內(nèi)提高時，細菌素的活性會進一步降低，但超過某一限值，繼續(xù)增加Tween80的濃度時，細菌素的活性卻不再繼續(xù)降低了。這一結(jié)果說明，表面活性劑不僅直接影響細菌素肽結(jié)構(gòu)，當其濃度達到某一限量時也會提高檢驗菌株的抗性。

3 結(jié)論

通過嗜酸乳桿菌的發(fā)酵實驗研究表明，嗜酸乳桿菌在添加了油酸的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)16h后達到產(chǎn)細菌素高峰；對發(fā)酵基質(zhì)中的細菌素分離純化研究包括三個步驟：硫酸銨沉淀、離子交換色譜（IEC）和疏水作用色譜（HIC）。陰離子表面活性劑都會使抑菌能力提高；非離子表面活性劑的作用則因化合物而異；陽陰離子表面活性劑β－巰基乙醇也會使抑菌能力顯著降低，但是加入DTT和尿素卻觀察不到細菌素活性的明顯變化。而十六烷基溴化三甲胺陽離子的作用應(yīng)該屬特殊的例證，尚有待進一步研究。Tween80使細菌素活性降低的程度是具有濃度依賴關(guān)系的。當加入的Tween80的濃度在一定范圍內(nèi)提高時，細菌素的活性會進一步降低，但超過某一限值，繼續(xù)增加Tween80的濃度時，細菌素的活性卻不再繼續(xù)降低了。

［1］ 葉巍，霍貴成.乳酸菌細菌素應(yīng)用研究進展［J］.乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2006（2）：56－58.

［2］ 張艾青，劉書亮，敖靈.產(chǎn)廣譜細菌素乳酸菌的篩選和鑒定［J］.微生物學(xué)通報，2007（4）：112－120.

［3］ 石金舟，陳麗園，張明，等.1株產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選和鑒定［J］.中國微生態(tài)學(xué)雜志，2005（6）：75－79.

［4］ 張大為，呂嘉櫪.嗜酸乳桿菌WS所產(chǎn)細菌素生物學(xué)特性的研究［J］.食品工業(yè)科技，2005.（7）：70－71.

［5］ Deraz S，Karlsson NE，Hedstr·mM，Andersson MM，Mattiasson B.Purification and characterisation of acidocin D20079，a bacteriocin produced by Lactobacillus acidophilus DSM 20079［J］.J Biotechnol.2005，117：343－354.