姜竹，張云湖，孟利強，曹旭，李晶＊

（1.黑龍江護理高等專科學校，哈爾濱150086；2.黑龍江省生物工程重點實驗室，黑龍江科學院微生物研究所，哈爾濱150010）

人參為五加科名貴中藥材。土傳病害是制約人參產(chǎn)量和質(zhì)量的主要因素之一，在我國每年由于土傳病害所造成的產(chǎn)量損失可達20%～50%，并且嚴重地削弱了我國人參產(chǎn)品在國際市場上的競爭能力。利用生防菌防治人參土傳病害是一種高效、安全的植保新途徑。近年對人參土傳病害的生防研究主要集中在木霉菌的篩選和利用［1－4］。筆者從患病人參根際土中篩選獲得兩株對人參土傳病菌具較強拮抗作用的生防菌株B59和X1［5］，通過對兩菌株的發(fā)酵培養(yǎng)基、最佳發(fā)酵條件的研究，為其開發(fā)利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株。生防菌株X1和B59由黑龍江省生物工程重點實驗室分離、鑒定并保存。

1.2 方法

1.2.1 種子液制備 。將保存于－70℃的細菌菌株轉(zhuǎn)接到裝有5mL NYD培養(yǎng)基的試管中，37℃，150r／min振蕩培養(yǎng)18h。將培養(yǎng)好的菌株劃線到NYDA平板上，37℃培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)18h。挑取單菌落再次接種到裝有5mL NYD試管培養(yǎng)基中，37℃，150r／min振蕩培養(yǎng)18h。

1.2.2 培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

（1）不同種類碳源對X1和B59菌株生長的影響。分別用1%葡萄糖、可溶性淀粉、玉米淀粉和蔗糖等量替代基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖制成培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基中接種量為1%，37℃、160r／min搖床培養(yǎng)18h，采用可見分光光度計測定發(fā)酵液OD600值，用無菌相應的培養(yǎng)液稀釋3倍，以相應的無菌培養(yǎng)基為空白對照，重復3次。

（2）不同種類的氮源對X1和B59菌體生長的影響。分別用1%酵母浸出物、胰蛋白胨、牛肉膏、牛肉膏＋酵母膏（1∶1）等量替代基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源制成培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基中接種量為1%，37℃、160r／min搖床培養(yǎng)18h，采用可見分光光度計測定發(fā)酵液OD600值，用無菌相應的培養(yǎng)液稀釋3倍，以相應的無菌培養(yǎng)基為空白對照，重復3次。

（3）不同種類的無機鹽對X1和B59菌體生長的影響。分別用0.5%硫酸錳，硫酸鎂，磷酸二氫鈉＋磷酸二氫鈉（1∶1），氯化鉀，氯化鈣，及不加無機鹽的空白培養(yǎng)基。每種培養(yǎng)基中接種量為1%，37℃、160r／min搖床培養(yǎng)18h，采用可見分光光度計測定發(fā)酵液OD600值，用無菌相應的培養(yǎng)液稀釋3倍，以相應的無菌培養(yǎng)基為空白對照，重復3次。

（4）培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的正交試驗。根據(jù)以上單因素發(fā)酵培養(yǎng)基成分的試驗結果，選定發(fā)酵培養(yǎng)基各營養(yǎng)成分，每種成分設計3個濃度水平，采用正交試驗方案。選用正交表L9（33）進行正交設計（表1），按照表內(nèi)方案配制培養(yǎng)基，并按上面培養(yǎng)條件篩選的結果，進行培養(yǎng)。采用可見分光光度計測定，根據(jù)發(fā)酵液OD600值對培養(yǎng)基中各種成分的含量進行調(diào)整。

表1 X1和B59菌株碳源、氮源、無機鹽L9（33）正交設計試驗的因素和水平表 g·L－1

1.2.3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

（1）初始pH值的確定。將優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基的pH值分別調(diào)節(jié)為5.0、6.0、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0，接種0.5%的種子培養(yǎng)液，37℃、160r／min搖床培養(yǎng)18h，采用可見分光光度計測定發(fā)酵液OD600值，用無菌NYD培養(yǎng)液稀釋3倍，以無菌NYD培養(yǎng)基為空白對照，重復3次。

（2）需氧量的確定。在優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基的基礎上，向250mL搖瓶中加入25、50、75、100、125mL的優(yōu)化后液體培養(yǎng)基，接種0.5%的種子培養(yǎng)液，37℃、160r／min搖床培養(yǎng)18h，采用可見分光光度計測定發(fā)酵液OD600值，用無菌NYD培養(yǎng)液稀釋3倍，以無菌NYD培養(yǎng)基為空白對照，重復3次。

（3）接種量的確定。向優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中分別接種0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的種子培養(yǎng)液，37℃160r／min搖床培養(yǎng)18h，采用可見分光光度計測定發(fā)酵液OD600值，用無菌NYD培養(yǎng)液稀釋3倍，以無菌NYD培養(yǎng)基為空白對照，重復3次。

（4）培養(yǎng)溫度的確定。向優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中接種0.5%的種子培養(yǎng)液，分別于20、25、30、35、40℃下培養(yǎng)，160r／min搖床培養(yǎng)18h，采用可見分光光度計測定發(fā)酵液OD600值，用無菌NYD培養(yǎng)液稀釋3倍，以無菌NYD培養(yǎng)基為空白對照，重復3次。

（5）搖床轉(zhuǎn)速的確定。向優(yōu)化后的液體培養(yǎng)基中接種0.5%的種子培養(yǎng)液，分別于40、80、120、160、200r／min 37℃搖床培養(yǎng)18h，采用可見分光光度計測定發(fā)酵液OD600值，用無菌NYD培養(yǎng)液稀釋3倍，以無菌NYD培養(yǎng)基為空白對照，重復3次。

2 結果與討論

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 不同種類碳源對菌株生長的影響

枯草芽孢桿菌X1和B59菌株在利用可溶性淀粉作為碳源時，產(chǎn)生了白色渾濁物，影響吸光值OD600。即含有可溶性淀粉的培養(yǎng)液中吸光值OD600較含有葡萄糖的細菌培養(yǎng)液的吸光值OD600高，但菌濃度低。葡萄糖、蔗糖和玉米淀粉作為碳源時未出現(xiàn)混濁物。所以，枯草芽孢桿菌X1和B59的最佳碳源為葡萄糖。結果見圖1。

2.1.2 不同種類氮源對菌株生長的影響

分別以牛肉膏、酵母膏、牛肉膏＋酵母膏（1∶1）、胰蛋白胨作為氮源，研究不同氮源對菌種生長的影響，結果表明（見圖1）：用牛肉膏＋酵母膏作為氮源時，枯草芽孢桿菌X1和B59菌株的生長明顯優(yōu)于單獨加入牛肉膏、酵母膏和胰蛋白胨?？莶菅挎邨U菌B1和B59菌株生長的最佳氮源是牛肉膏＋酵母膏、其次是牛肉膏。如圖2。

圖1 不同碳源對菌種B59和X1菌株生長的影響

圖2 不同種類的氮源對X1菌株和B59菌株生長的影響

2.1.3 不同種類無機鹽對菌株生長的影響

以 KCl、MgSO4、CaCl2、MnSO4、空白、NaH2PO4＋Na2HPO4作為無機鹽因子，研究不同無機鹽對X1和B59菌株生長的影響，結果表明（見圖3），NaH2PO4＋Na2HPO4作為無機鹽時枯草芽孢桿菌B59和X1的生長明顯優(yōu)于其它無機鹽?？莶菅挎邨U菌X1和B59菌株生長的最佳無機鹽是NaH2PO4＋Na2HPO4。

圖3 不同種類無機鹽對X1菌株和B59菌株生長的影響

2.1.4 正交試驗

通過單因素試驗初步確定，B59菌株的最佳碳源、氮源和無機鹽分別為葡萄糖、牛肉膏和NaH2PO4＋Na2HPO4。X1菌株的最佳碳源、氮源和無機鹽分別為葡萄糖、牛肉膏＋酵母膏（1∶1）和NaH2PO4＋Na2HPO4。

通過三因素二水平進行正交實驗。X1菌株碳源、氮源、無機鹽L9（33）正交設計試驗的因素和水平見表1，試驗處理組合及X1菌株OD600值和各列水平平均數(shù)和極差（Rj）見表2。

表2 X1菌株碳源、氮源、無機鹽L9（33）正交設計試驗的結果及分析

B59菌株碳源、氮源、無機鹽L9（33）正交設計試驗的因素和水平見表1，試驗處理組合及B59菌株OD600值和各列水平平均數(shù)和極差（Rj）見表3。

表3 B59菌株碳源、氮源、無機鹽L9（33））正交設計試驗的結果及分析

枯草芽孢桿菌X1和B59菌株培養(yǎng)基正交設計各處理Rj絕對值大小代表不同因素對發(fā)酵液菌數(shù)的影響程度，其值越大，影響程度越大；反之，其值越小，影響程度越小。因此可以看出三種因素對枯草芽孢桿菌X1菌株發(fā)酵液單位的影響大小依次為：葡萄糖＞NaH2PO4＋Na2HPO4＞牛肉膏＋酵母膏；B59菌株發(fā)酵液單位的影響大小依次為：葡萄糖＞NaH2PO4＋Na2HPO4＞牛肉膏。

枯草芽孢桿菌X1和B59菌株培養(yǎng)基正交設計各處理Rj絕對值大小代表不同因素對發(fā)酵液菌數(shù)的影響程度，其值越大，影響程度越大；反之，其值越小，影響程度越小。因此可以看出三種因素對枯草芽孢桿菌X1菌株發(fā)酵液單位的影響大小依次為：葡萄糖＞NaH2PO4＋Na2HPO4＞牛肉膏＋酵母膏；B59菌株發(fā)酵液單位的影響大小依次為：葡萄糖＞NaH2PO4＋Na2HPO4＞牛肉膏。

分析原因為：葡萄糖可以迅速的被菌體吸收利用，轉(zhuǎn)變?yōu)槟芰?，碳源對發(fā)酵結果的影響與無機鹽和氮源相比效果最大。選擇較大的yi值所對應的水平作為該因素的最佳水平，即如果某因素y1＞y2，則選擇1水平作為該因素的最佳水平；如果某因素y2＞y1，則選擇2水平作為該因素的最佳水平。因此，得出枯草芽孢桿菌X1菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳組合為：A3，B2，C1；最佳培養(yǎng)基成分組成為：葡萄糖15g／L，牛肉膏＋酵母膏（1∶1）10.0g／L，NaH2PO4＋Na2HPO42.5g／L?？莶菅挎邨U菌B59菌株發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳組合為：A3，B1，C2；最佳培養(yǎng)基成分組成為：葡萄糖15g／L，牛肉膏5.0g／L，NaH2PO4＋Na2HPO45g／L。

2.2 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 枯草芽孢桿菌X1和B59菌株培養(yǎng)基初始pH值的確定

在培養(yǎng)條件不變，只改變培養(yǎng)基初始pH值，研究初始pH值對枯草芽孢桿菌X1和B59生長的影響。結果表明，在初始pH值為5.0～10之間時，發(fā)酵液中枯草芽孢桿菌X1和B59的生長大體趨勢呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢。當pH值為8.0時，X1和B59菌株生長最好（見圖4）。因此，在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌X1和B59過程中的初始pH值宜選擇8.0。

圖4 初始pH值對枯草芽孢桿菌X1和B59菌株生長的影響

2.2.2 枯草芽孢桿菌X1和B59菌株需氧量的確定

在采用優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上，其它培養(yǎng)條件不變，只改變裝液量，研究需氧量對枯草芽孢桿菌X1和B59菌株生長的影響（見圖5）。當用250mL搖瓶裝入培養(yǎng)液體積為25～125mL時，隨著裝液量的增加，發(fā)酵液的OD600隨著減少。當裝液量為25mL時，菌密度OD600最大，當裝液量為125mL時，菌密度OD600最小。因此，在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌X1和B59過程中的裝液量宜選擇250mL三角瓶裝入25mL優(yōu)化培養(yǎng)液。

圖5 需氧量對枯草芽孢桿菌X1和B59菌株生長的影響

2.2.3 枯草芽孢桿菌B59和X1菌株接種量的確定

2.2.3.1 枯草芽孢桿菌B59菌株接種量的確定。在采用基本培養(yǎng)基的基礎上，其它培養(yǎng)條件不變，只改變接種量，研究接種量對枯草芽孢桿菌B59菌株生長的影響（見圖6）。接種量為0.5%～2.5%之間時，隨著接種量的增加，發(fā)酵液的OD600先增加再減少，且較為明顯。當接種量為1.5%時，枯草芽孢桿菌B59菌株的菌密度OD600最大；當接種量為0.5%時，OD600最小。因此，在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌B59過程中的接種量宜選擇1.5%。

圖6 不同接種量對枯草芽孢桿菌B59菌株生長的影響

2.2.3.2 枯草芽孢桿菌X1菌株接種量的確定。在采用優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上，其它培養(yǎng)條件不變，只改變接種量，來研究接種量對枯草芽孢桿菌X1菌株生長的影響（見圖7）。接種量為0.5%～2.5%之間時，隨著接種量的增加，發(fā)酵液的OD600先增加再減少。當接種量為1%時，枯草芽孢桿菌X1菌株的菌密度OD600最大；當接種量為2.5%時，OD600最小。因此，在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌X1過程中的接種量宜選擇1%。

圖7 不同接種量對枯草芽孢桿菌X1菌株生長的影響

2.2.4 枯草芽孢桿菌B59和X1菌株培養(yǎng)溫度的確定

在采用優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上，其它培養(yǎng)條件不變，只改變培養(yǎng)溫度，來研究溫度對枯草芽孢桿菌X1菌株、B59菌株生長的影響（見圖8）。溫度為20～40℃之間時，隨著接種量的增加，枯草芽孢桿菌X1菌株發(fā)酵液的OD600先增加再減少。當溫度為25℃時，OD600最大；當溫度為40℃時，OD600最小。因此，在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌X1過程中的生長溫度宜選擇為25℃；當溫度為30℃時，枯草芽孢桿菌B59菌株OD600最大；當溫度為40℃時，OD600最小。因此，在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌B59過程中的生長溫度宜選擇為30℃。

圖8 不同培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌和B59菌株生長的影響

2.2.5 枯草芽孢桿菌X1和B59菌株搖床轉(zhuǎn)速的確定

采用優(yōu)化培養(yǎng)基的基礎上，其它培養(yǎng)條件不變，只改變搖床轉(zhuǎn)速，研究搖床轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌X1和B59菌株生長的影響（見圖9）。轉(zhuǎn)速為40～200r／min之間時，隨著轉(zhuǎn)速的增加，枯草芽孢桿菌X1和B59菌株發(fā)酵液的OD600也隨著增加。當轉(zhuǎn)速為160 r／min時，OD600最大；當溫度為40r／min時，OD600最小。因此，在培養(yǎng)枯草芽孢桿菌X1和B59菌株過程中的轉(zhuǎn)速宜選擇為160r／min。

圖9 不同搖床轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌X1和B59菌株生長的影響

2.3 枯草芽孢桿菌X1和B59菌株的培養(yǎng)優(yōu)化結果

枯草芽孢桿菌X1菌株的最佳培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件為：葡萄糖15g／L，牛肉膏＋酵母膏（1∶1）10.0g／L，NaH2PO4＋Na2HPO42.5g／L，pH為8，250mL三角瓶中裝入25mL培養(yǎng)基，接種量為1%，25℃，160r／min培養(yǎng)。

枯草芽孢桿菌B59菌株的最佳培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件為：葡萄糖15g／L，牛肉膏5.0g／L，NaH2PO4＋Na2HPO45g／L，pH為8，250mL三角瓶中裝入25mL培養(yǎng)基，接種量為1.5%，30℃，160r／min培養(yǎng)。

用優(yōu)化后的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)18h后，用平板對峙法做對人參腐皮鐮孢菌（F.solani）抑菌試驗，5d后觀察、測量抑菌率；并與原始的NYD發(fā)酵培養(yǎng)基，以1%接菌量，250mL三角瓶裝液50mL，160r／min，37℃培養(yǎng)18h，比較活菌數(shù)。試驗結果表明，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件培養(yǎng)B59和X1菌株的活菌數(shù)明顯高于利用NYD培養(yǎng)基培養(yǎng)的活菌數(shù)。優(yōu)化培養(yǎng)的枯草芽孢桿菌X1和B59菌株對人參腐皮鐮孢菌抑菌能力顯著提高（圖10）。菌株X1抑菌率由85.2%提高到93.4%。

圖10 菌株X1優(yōu)化前后抑菌活性的比較

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