王連春， 彭杰軍， 郭維霞， 李曉鵬， 孔寶華， 陳海如

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室，昆明 650201）

香石竹（Dianthus caryophyllus Linn.）又名康乃馨（carnation），是一種深受人們喜愛的鮮切花。香石竹能受多種病毒侵染危害，其中影響最大的是香石竹斑駁病毒（Carnation mottle virus，CarMV），屬于番茄叢矮病毒科（Tombusviridae）麝香石竹斑駁病毒屬（Carmovirus）。CarMV是麝香石竹斑駁病毒屬的典型成員，其全長約4003nt（GenBank：AF192772），可能有5個閱讀框架（圖1），分別為p28ku、p28ku通讀產(chǎn)生的p88ku、p7ku、p9ku、p38ku；其中p88可能具有RNA依賴的RNA聚合酶功能，p7和p9可能都具有運動蛋白功能，而p38則執(zhí)行外殼蛋白功能［1－2］。但是否存在 CarMVgp1兩個TAG終止子通讀框架還有待進(jìn)一步證明。目前深入研究較多的是p7和p38兩個蛋白，研究表明p7可能具有運動蛋白的功能，其C末端具有RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域［3］，蛋白定位表明在病毒侵染擴(kuò)散時p7會在細(xì)胞壁附近富集［4］，這也與運動蛋白可以輔助病毒通過胞間連絲運動的結(jié)果相符；而p38作為外殼蛋白是保護(hù)病毒的屏障［5］，也是直接與外界接觸的部分，因此p38蛋白也經(jīng)常作為CarMV病毒檢測的抗原［6－8］。由于外殼蛋白執(zhí)行保護(hù)作用，為了適應(yīng)不同環(huán)境其變異也會比較大，科研工作者通常將外殼蛋白作為病毒進(jìn)化分類的重要依據(jù)，CarMV也不例外，Canizares等［9］根據(jù)CP氨基酸序列164和331兩個位置氨基酸變化的相關(guān)性，把CarMV分為P164K331和A164N331兩個主要組群。

圖1 CarMV閱讀框架分析

CarMV是一種重要的花卉病毒，對于它各個蛋白的功能及其相互關(guān)系的研究是防治CarMV的前提，但目前研究主要集中在病毒檢測、遺傳進(jìn)化、運動蛋白和外殼蛋白的研究，對于其他閱讀框架如p88、p28、p9等的功能研究較少，而且p88、p9、p7、p38四個蛋白的核苷酸序列都有不同程度的重疊，這種表達(dá)方式對于CarMV是否具有一定的生物學(xué)意義僅通過單獨閱讀框架的表達(dá)很難進(jìn)行研究；再者CarMV的原始寄主是香石竹，其遺傳背景不清楚無法直接進(jìn)行病毒與寄主間互作研究，因此構(gòu)建CarMV的全長侵染克隆是解決以上問題的快捷方法。本研究旨在構(gòu)建一個農(nóng)桿菌介導(dǎo)的能侵染煙草等模式植物的CarMV cDNA全長侵染性克隆，從而滿足進(jìn)一步研究CarMV病毒的需要。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 感病樣品

13個具有典型病害癥狀（如植株矮化，畸形，生長衰弱，花朵變小或雜色，花苞開裂等）的香石竹樣品來源于昆明市斗南花卉市場。

1.1.2 質(zhì)粒與菌株

真核表達(dá)載體pCV－nGFP、大腸桿菌［Escherichia coli（Migula）Castellani et Chalmers］DH5α、農(nóng) 桿 菌 ［Agrobacerium tumefaciens （Smith Townsend）Conn］C58C1由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院病毒學(xué)與生物技術(shù)研究所陳劍平院士惠贈。

1.1.3 酶及試劑

RNeasy Plant mini Kit、QIAquick Gel Purification Kit購自 QIAGEN公司；T4DNA Ligase、pGEM－T vector購自Promega公司；EX TaqTM、各種限制性內(nèi)切酶、Ribonuclease H（RNase H）、Ribonuclease Inhibitor、AMV Reverse Transcriptase、DNA Ligation Kit ver.2、pMD19－T購自TaKaRa。

1.1.4 引物

根據(jù)登錄號為NC＿001265.1的上海分離物設(shè)計引物（表1），引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 CarMV全長序列構(gòu)建引物

利用BamHI（GGATCC）、KpnI（GGTACC）和SacI（GAGCTC）將病毒片段分為兩段連入pCV－nGFP為載體。

1.2 方法

1.2.1 CarMV RT－PCR檢測及全基因組序列克隆

參照Invitrogen公司的Trizol法提取植物總RNA，以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄后利用Car－MV－3和CarMV－4PCR擴(kuò)增CarMV全長，回收目的片段連接到pMD19－T載體，藍(lán)白斑篩選出陽性克隆，送生工測序。

1.2.2 農(nóng)桿菌浸潤

將構(gòu)建好的侵染性克隆載體pCV－CarMV通過電擊法導(dǎo)入農(nóng)桿菌C58C1，再挑取單菌落接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，220r／min 28℃振蕩培養(yǎng)24h。取500μL菌液轉(zhuǎn)接于5mL LB液體培養(yǎng)基中，28℃220r／min振蕩培養(yǎng)至A600＝0.6。5 000r／min離心10min收集菌體用轉(zhuǎn)染緩沖液（10mmol／L MES、10mmol／L MgCl2和150μmol／L乙酰丁香酮）懸浮，A600調(diào)至1.0，室溫放置12h后通過5mL針筒浸潤到6葉期本氏煙。pCV－CarMV農(nóng)桿菌侵染時每次接種10株6葉期本氏煙，重復(fù)3次，同時以浸潤空載體農(nóng)桿菌為陰性對照。

1.2.3 CarMV侵染植物 RT－PCR檢測

對浸潤C(jī)arMV和對照煙草植株提取系統(tǒng)葉片總RNA，以O(shè)ligdT為引物反轉(zhuǎn)錄CarMV的cDNA第1鏈，以CarMV－C－2f和CarMV－C－2r為引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 CarMV RT－PCR檢測及全基因組序列測定

為確定所取病樣是否含有CarMV，本試驗將斗南花市獲得的樣品提取植物總RNA反轉(zhuǎn)錄，利用特異引物CarMV－1和CarMV－2進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示所取樣品中有13個樣品能擴(kuò)增出1 700bp左右的條帶，由此表明此13個樣品均含有CarMV（圖2）。

圖2 斗南花市13個香石竹樣品CarMV PCR檢測

為獲得CarMV云南分離物的全長序列，本試驗以其中一個樣品為模板，利用引物CarMV－3和CarMV－4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得病毒全長序列連入pMD19－T，構(gòu)建的重組質(zhì)粒為T－CarMV送至生工測序。測序結(jié)果表明，CarMV云南分離物RNA全長共4 003bp（登錄號 HQ660513.1）。軟件DNAMAN分析云南分離物與上海分離物（登錄號為NC＿001265.1）的差異，結(jié)果表明，兩者相似性達(dá)94.78%。對兩者的氨基酸分析表明，p88（805～807位置的TAG通讀）氨基酸序列相似性100%；而p9有兩個氨基酸差異，分別為第11位E→G，第14位M→L；p7序列第3位A→V，第7位P→L，第23位R→K；p38變化較大有6處差異，分別為第67位S→P，第92位C→S，第284位I→F，第329位M→I，第341位K→Q，第342位V→W。序列比較結(jié)果顯示，上海分離物與云南分離物之間沒有顯著差異。而根據(jù)Canizares等提供的分類標(biāo)準(zhǔn)顯示，云南分離物和上海分離物第164位為P，第331位為K，它們同屬于P164K331組群。

2.2 侵染性克隆構(gòu)建

本試驗以T－CarMV為模板將CarMV全長序列構(gòu)建至真核表達(dá)載體以便于農(nóng)桿菌瞬時轉(zhuǎn)染植物。CarMV－YN全基因序列分析表明，該基因組序列無BamHI和SacI酶切位點、在2 958bp位置具有KpnI酶切位點，因此本試驗利用這3個酶切位點將CarMV分為兩段連入表達(dá)載體。

經(jīng)序列分析發(fā)現(xiàn)，CarMV云南分離物先將引物CarMV－C－1f和CarMV－C－1r擴(kuò)增獲得的約3.0kb序列通過BamHI和KpnI酶切后連入pCV－nGFP載體構(gòu)建成pCV－BK，經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測正確后（圖3），繼續(xù)將CarMV－C－2f和CarMV－C－2r擴(kuò)增獲得的約1.0kb片段通過KpnI和SacI連入pCV－BK形成最終重組載體pCV－CarMV，利用PCR檢測片段2的連接情況（圖4），為進(jìn)一步確認(rèn)構(gòu)建載體的正確性，以CarMVC－1f和CarMV－C－2r為配對引物進(jìn)行全長PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示在4.0kb位置有擴(kuò)增條帶（圖5），測序結(jié)果也表明CarMV全長已經(jīng)構(gòu)建至雙元表達(dá)載體，可以用于侵染性分析。

圖5 CarMV云南分離物侵染性克隆全長PCR檢測

2.3 侵染性分析

為驗證構(gòu)建的CarMV－YN全長侵染性克隆是否具有侵染性，本研究將pCV－CarMV轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌C58C1，浸潤6葉期本氏煙，同時以pCV－nGFP浸潤6葉期本氏煙為陰性對照。轉(zhuǎn)染7d后浸潤空載體和pCV－CarMV農(nóng)桿菌的本氏煙上均未出現(xiàn)明顯癥狀。CarMV－C－2f、CarMV－C－2r引物進(jìn)行RT－PCR擴(kuò)增能檢測到一條1.0～1.1kb特異性條帶（圖6A），而對照沒有相應(yīng)條帶。14d后觀察發(fā)現(xiàn)，浸潤有pCV－CarMV農(nóng)桿菌的植株明顯比對照植株矮小，并有輕微花葉（圖6B）。上述試驗結(jié)果表明，本試驗構(gòu)建的CarMV全長克隆具有侵染性。

圖6 煙草系統(tǒng)葉片RT－PCR檢測及接毒后煙草生長情況

3 討論

本研究以香石竹CarMV云南分離物為研究材料，結(jié)果表明CarMV云南分離物全長4 003nt，與上海分離物同屬于P164K331組群，而核苷酸、氨基酸序列表明云南分離物和上海分離物沒有明顯差異，這也與Canizares等［9］研究結(jié)果相符，CarMV沒有明顯的地域和時間差異。同時本試驗以具有35S啟動子的pCV－nGFP雙元表達(dá)載體為基礎(chǔ)，在35S啟動子和NOS終止子之間插入CarMV的全長片段，利用農(nóng)桿菌直接侵染煙草，結(jié)果表明，本研究構(gòu)建的CarMV侵染性克隆具有侵染性。

植物病毒研究一直以來最難解決的是病毒的保存問題，植物病毒需要保存在寄主植物上才能保持侵染活性，而本試驗構(gòu)建的pCV－CarMV侵染性克隆以質(zhì)粒的形式離體保存，從而減少保存過程中的繁瑣工作；再者植物病毒復(fù)制速度快，通過不斷的轉(zhuǎn)接也可能導(dǎo)致病毒進(jìn)化從而無法保證病毒序列的保守性，進(jìn)而導(dǎo)致研究結(jié)果差異大，而農(nóng)桿菌介導(dǎo)的侵染性克隆由于質(zhì)?？梢宰晕覐?fù)制從而能保證病毒序列的保守性；寄主?；砸恢笔侵参锊《狙芯康钠款i，由于寄主遺傳背景不清楚，無法了解植物病毒侵染時植物發(fā)生變化的基因，但是本研究的侵染性克隆是以農(nóng)桿菌介導(dǎo)，通過農(nóng)桿菌直接將雙元表達(dá)載體注入寄主細(xì)胞中再通過35S強啟動子啟動Car－MV cDNA序列轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生病毒RNA序列，從而達(dá)到侵染的目的，因此也可以在已知遺傳背景的植物如煙草、擬南芥等模式生物中表達(dá)。

本研究全序列測定表明，CarMV可能具有5個閱讀框架，其中有p88是通過TAG通讀形成，但是CarMV病毒中是否會發(fā)生兩個TAG終止子的通讀翻譯出CarMVgp1蛋白（圖1），CarMVgp1蛋白具有何種功能目前尚未研究；CarMV中p88、p9、p7、p38四個蛋白其閱讀框架部分序列發(fā)生相互重疊，而這些重疊部分是否具有生物學(xué)功能也尚未可知，因此這些研究都可以通過對本試驗構(gòu)建的全長侵染性克隆的基因突變或缺失來完成。綜上所述，本研究構(gòu)建的CarMV侵染性克隆在煙草上具有侵染性，在CarMV基因功能、寄主互作等研究中具有一定的應(yīng)用價值。

［1］ Carrington J C，Morris T J.Complementary DNA cloning and analysis of Carnation mottle virus RNA［J］.Virology，1984，139（1）：22－31.

［2］ Garcia－Castillo S，Sánchez－Pina M A，Pallás V.Spatio－temporal analysis of the RNAs，coat and movement（p7）proteins of Carnation mottle virus in Chenopodium quinoa plants［J］.Journal of General Virology，2003，84：745－749.

［3］ Harbison S A，Wilson T M，Davies J W.An encapsidated，subgenomic messenger RNA encodes the coat protein of carnation mottle virus［J］.Bioscience Reports，1984，4（11）：949－956.

［4］ Kummert J.Synthesis and characterization of DNA complementary to carnation mottle virus RNA［J］.Virology，1980，105（1）：35－40.

［5］ Safari M，Koohi Habibi M，Mosahebi G，et al.Carnation mottle virus，an important viral agent infecting carnation cut－flower crops in Mahallat of Iran［J］.Communications in Agricultural and Applied Biological Sciences，2009，74（3）：861－865.

［6］ Vilar M，Esteve V，Pallas V，et al.Structural properties of Carnation mottle virus p7movement protein and its RNA－bind－ing domain［J］.The Journal Biological Chemistry，2001，276（21）：18122－18129.

［7］ 孔寶華，李文君，常勝軍，等.香石竹斑駁病毒（CarMV）云南分離物CP基因的克隆和序列分析［J］.Acta Phytopathologica Sinica，2003，33（2）：187－188.

［8］ 李婷婷，方琦，丁銘，等.昆明麝香石竹斑駁病毒分離物的鑒定與提純及高效價抗血清的制備［J］.西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，21（2）：346－348.

［9］ Canizares M C，Marcos J F，Pallas V.Molecular variability of twenty－one geographically distinct isolates of Carnation mottle virus（CarMV）and phylogenetic relationships within the Tombusviridae Family［J］.Archives of Virology，2001，146（10）：2039－2051.