徐薪惟， 李景富， 姜景彬， 張 賀，康立功， 陳秀玲， 王傲雪， 許向陽

（東北農(nóng)業(yè)大學，哈爾濱 150030）

番茄是世界各地廣泛栽培的重要經(jīng)濟作物，隨著其大棚種植面積的迅速擴大，靠土壤傳染的菌量逐年累積，番茄枯萎病的發(fā)生日趨嚴重。程愛昀［1］對山東濟寧地區(qū)大棚番茄枯萎病進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病的一般發(fā)病率為20%～30%，嚴重地塊達80%～90%，甚至全部毀種。而培育優(yōu)良抗病品種是解決番茄病害問題的有效途徑。早在1940年Wellman［2］就發(fā)現(xiàn)番茄枯萎病菌有生理小種的分化，并存在3個生理小種［3－5］，且相應(yīng)在野生番茄中找到了3個抗病基因即I－1、I－2、I－3。它們都是由顯性單基因或半顯性單基因控制的［6］。I－1基因?qū)ι硇》N1具有抗性，但對其研究不夠深入。Paddock［7］通過研究將I－1基因定位到第11條染色體上，Sarfatti［8］則將其定位于第7條染色體上。李發(fā)玲等［9］對 I－1 基 因 進 行 分 析，發(fā) 現(xiàn) AFLP 標 記E41M60－D標記與該基因緊密連鎖。Sarfatti等［10］獲得了番茄I－2基因的RFLP標記TG105，該標記與I－2基因緊密連鎖（0.4cM）。I－2 基因來源于醋栗番茄的顯性基因，被定位到第11條染色體長臂的7個相似的基因簇內(nèi)［11］。于拴倉等［12］根據(jù)I－2 的基因序列設(shè)計特異擴增引物，建立了I－2基因的共顯性分子標記，F(xiàn)ukuta等［13］根據(jù)I－2 基因序列設(shè)計特異擴增引物，開發(fā)出了可以區(qū)分含有I－2基因和不含I－2基因的材料。I－3基因被定位到第7條染色體的長臂上［14］，Lim等［15］利用31對基于PCR技術(shù)的標記繪制了I－3基因在第7條染色體的高分辨率圖，將I－3基因定位于分子標記RGA332和bP23／gPT之間的0.38cM的間隔內(nèi)。由于I－2基因同時抗番茄枯萎病生理小種1和2，因此受到重視。

目前，分子標記輔助選擇已成為蔬菜分子育種的關(guān)鍵技術(shù)。SNP標記作為第3代DNA遺傳標記，可以把復雜的性狀作為單基因性狀進行分析和選擇，一旦找到緊密連鎖的分子標記，就可以在育種工作中進行標記輔助選擇。Kota等［16］對大麥7個基因型的180個EST位點進行SNP研究，檢測到了72個SNP，這些SNP標記被用來研究大麥的親緣關(guān)系。周永明等［17］用引物擴增低芥酸甘藍型油菜和高芥酸甘藍型油菜基因組DNA，將所得DNA片段進行序列比對，發(fā)現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性并設(shè)計特異引物，經(jīng)群體檢驗獲得了與甘藍型油菜低芥酸基因連鎖的共顯性SNP分子標記。SNP分型是SNP研究領(lǐng)域的重要課題，根據(jù)不同的研究需要已建立了不同的分型方法，其中等位基因特異PCR法（AS－PCR）通過對特異引物的巧妙設(shè)計，能夠?qū)⒉煌腟NP基因型分辨開來，具有費用低，程序簡單，易于操作等優(yōu)點［18］。本研究試圖建立適合于番茄I－2基因SNP分型的AS－PCR反應(yīng)體系，為番茄抗枯萎病I－2基因的分子標記連鎖作圖打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄抗枯萎病品種‘07878’、‘07898’、‘07916’，感病品種‘07875’、‘07920’、‘07932’。上述材料均由東北農(nóng)業(yè)大學園藝學院番茄課題組提供。番茄枯萎病菌屬生理小種2，由東北農(nóng)業(yè)大學園藝系番茄課題組提供。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank上提供的I－2 基因序列（AF118127.1），利用Primer 5.0軟件設(shè)計特異擴增的PCR引物，共設(shè)計4對引物，篩選擴增性較好的引物對 S2：TACGCTCCAAATCAGAGGA，A2：TTCCGTCACCACTCTTATTCCA，由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。該引物擴增番茄I－2基因1 142～2 466bp間的片段。

1.2.2 番茄基因組提取及PCR擴增

將所有番茄試驗材料播種于溫室內(nèi)，待長出兩片真葉時取幼嫩的葉片用CTAB法提取DNA。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，λDNA作為Marker，以檢查DNA濃度；紫外分光光度計測定樣品的純度。

PCR擴增：PCR反應(yīng)體積為25μL，其中包括dNTP（2.0mmol／L）2.0μL，10×PCR buffer 2.0μL，MgCl2（25mmol／L）1.3μL，上下游引物 （10μmol／L）各1.0μL，模板0.5μL，Pfu酶0.5μL，用ddH2O補足25μL。用德國Biometra T－Gradient Themoblock型PCR儀擴增，熱循環(huán)程序為：94℃預變性5.0min、94℃變性30s、58℃復性30s、72℃延伸70s共30個循環(huán)，72℃延伸7.0min。PCR擴增產(chǎn)物用0.8%瓊脂糖電泳檢測。

1.2.3 差異條帶的克隆、測序和比對分析

擴增產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測后回收?；厥盏哪康钠闻cTaKaRa公司的pMD18－T Vector在T4連接酶的作用下16℃連接過夜并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α。經(jīng)藍白斑篩選后挑取單菌落，在液體LB培養(yǎng)基搖菌培養(yǎng)過夜，堿裂解法制備質(zhì)粒，經(jīng)HindⅢ和PstⅠ酶切電泳鑒定為陽性克隆后送北京華大測序。用DNAMAN，DNAStar軟件系統(tǒng)的Editseq、Seqman、MegAlign軟件包分析已測序列，在I－2基因的1793、1963位獲得基因組特異的差異。

1.2.4 等位基因特異引物的設(shè)計

為了在不同材料中檢測目標SNP，采用等位基因特異 PCR 方法（allele－specific PCR，AS－PCR），將SNP置于引物3′端并在特異引物的3′端引入1～2個錯配堿基，以增加等位基因特異性PCR的擴增效果，再利用Primer 5.0在序列的5′端設(shè)計公用的正義鏈引物。同時，還設(shè)計了與等位基因特異PCR引物的互補引物（表1），來驗證等位基因特異PCR引物的可靠性。優(yōu)化PCR擴增條件，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測該引物在不同番茄品種中的多態(tài)性。

表1 基于1793和1963位特異性引物的設(shè)計1）

1.2.5 抗番茄枯萎病種質(zhì)資源的篩選

在培養(yǎng)基上大量繁殖番茄枯萎病菌，采用浸根法接種52份種質(zhì)資源，15d后調(diào)查，記錄發(fā)病情況［19］。將群體分為抗病和感病兩類，并與AS－PCR檢測結(jié)果進行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄抗枯萎病I－2基因的克隆

以S2和A2為引物，利用不同抗性番茄品種的基因組DNA為模板得到了穩(wěn)定的特異擴增產(chǎn)物。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定（圖1），大小約為1.3kb，與I－2 預期擴增一致，經(jīng)3次重復，結(jié)果穩(wěn)定一致。將I－2基因構(gòu)建pMD18－T克隆載體并酶切鑒定插入片段的大?。▓D2）。從圖1、2中可以看出，所要擴增的I－2基因片段與限制性酶切后的片段大小相符，表明所擴增的目的片段已連接到載體上。將菌液送到北京華大公司進行測序。

圖1 S2、A2引物對不同番茄品種基因組DNA PCR擴增結(jié)果

2.2 I－2基因的單核苷酸多態(tài)性分析

通過對不同番茄品種的測序結(jié)果多重序列比對，序列相似性達96.64%。序列中有49個單核苷酸突變位點，兩個插入／缺失位點。根據(jù)序列中1793位C／T及1963位G／A設(shè)計SNP特異引物。

圖2 重組質(zhì)粒pMD18－T／I－2基因的酶切鑒定

2.3 引物3′端不同位置堿基錯配及不同堿基錯配類型對PCR結(jié)果的影響

為了研究等位基因特異引物3′端不同位置堿基錯配對AS－PCR的影響，在試驗中分別在引物3′端第1、2、3位引入不同位置的堿基錯配以及錯配堿基的數(shù)目，研究其對PCR產(chǎn)物的影響。在SNP位點1 793位和1 963位處，引物R1和R11分別在供試材料中得到了有明顯差異的擴增產(chǎn)物，而在引物3′端的第1、3位置設(shè)計錯配堿基的引物R2和R22在供試材料中均能擴增出條帶，說明引物3′端第1、2位堿基錯配對抑制等位基因特異引物與模板的結(jié)合起重要作用。

為了研究不同堿基錯配類型對AS－PCR的影響，在1793位設(shè)計引物R3和R4，引物R3為C／T錯配，引物R4為C／A錯配。從圖3可以看出，R4產(chǎn)物較弱，因此，C／T錯配強于C／A錯配。在1 963位的檢測中，引物R33的TA變成CG形成AT－CG型錯配。由于T－G屬于弱錯配而A－C也為弱錯配，并未擴增出條帶，說明弱的錯配堿基可能會削弱引物與模板的結(jié)合能力。結(jié)果與衛(wèi)波等［20］通過對小麥抗旱相關(guān)基因SNP標記的研究認為在引物3′端第2位和第3位同時置入錯配堿基，就可以有效抑制引物與模板的結(jié)合相似。在此基礎(chǔ)上，設(shè)計引物R44引入A－G強錯配并置于3′端第2位與SNP相隔一個堿基，獲得了特異性條帶。因此可以有效地阻止非特異性的擴增。

2.4 互補引物檢測SNP基因型

針對I－2基因在1793位的SNP位點，用優(yōu)化的AS－PCR體系對52份種質(zhì)資源進行分型。利用特異性較好的引物R1設(shè)計互補引物P1，相互驗證兩對引物的正確性，也可以檢測兩種材料在SNP位點基因型是純合基因型還是雜合基因型。凡是用引物R1獲得特異性差異的基因型在該位點是純合基因型C／C。凡是用引物P1獲得特異性差異的基因型在該位點是純合基因型T／T。同時在引物R1和P1中獲得目的片段的為C／T雜合SNP基因型。結(jié)果如圖4所示，株系1、5、6、9、12為純合抗病基因型C／C，株系4、7為純合感病基因型T／T，株系2、3、8、10、11、13為雜合抗病基因型C／T。

2.5 抗番茄種質(zhì)資源的篩選

通過對52份種質(zhì)資源進行苗期抗枯萎病生理小種2田間鑒定，調(diào)查出抗病品種40份，感病品種12份。實驗室利用SNP標記引物獲得抗病品種42份，感病品種10份。通過對番茄材料的分子和人工鑒定比較，吻合率較高，可用于苗期抗枯萎病的檢測。

3 討論

番茄枯萎病是土傳性病害，本試驗采用浸根法對番茄52份種質(zhì)資源進行苗期抗枯萎病生理小種2田間鑒定，其中抗病品種40份，感病品種12份，實驗室利用SNP標記引物獲得抗病品種42份。由于植物病害癥狀的穩(wěn)定性是相對的，有一個發(fā)生發(fā)展的過程，并存在一定的變異性，所以人工接種鑒定的方法存在一定的不準確性，導致檢測的結(jié)果稍有不同，但吻合率較高，證明該標記可在苗期對番茄枯萎病的抗病資源進行篩選，且能夠免去大量的田間測試工作，顯著提高選擇效率，有效避免人工接種產(chǎn)生的誤差。通過SNP標記發(fā)掘優(yōu)異的抗枯萎病番茄基因資源，對培育高產(chǎn)抗病番茄品種，促進番茄生產(chǎn)的發(fā)展具有重要理論意義和實際應(yīng)用價值。

在等位基因特異引物設(shè)計方面，起初利用只在3′端第一位引入錯配堿基來區(qū)分抗感品種，結(jié)果沒有獲得特異條帶。因為在普通的PCR擴增中，引物與模板匹配的堿基只有一個差異容易造成錯配，從而引起假陽性。在5′端第一位引入錯配堿基也未能獲得有明顯差異的特異條帶，因為番茄基因組對引物序列的選擇性，這種對序列的“偏好”以引物3′端序列更顯得關(guān)鍵一些［21］。

堿基錯配根據(jù)不穩(wěn)定性分為3類：強錯配型（C／T和G／A）、中等錯配型（C／A和 G／T）和弱錯配型（A／A、C／C／、G／G和 T／T），在特異引物3′端錯配堿基強弱搭配，或者中中搭配，獲得理想擴增效果的可能性較大［22］。試驗中選用C／T和C／A錯配，C／T錯配獲得了較好的差異條帶，這與預期結(jié)果一致；3′端第2和第3位設(shè)計AT－CG型錯配由于T－G屬于弱錯配而A－C也為弱錯配，并未擴增出條帶，說明弱的錯配堿基會削弱引物與模板的結(jié)合能力；引入A－G強錯配并置于3′端第2位與SNP相隔一個堿基，獲得了特異性條帶，可以有效地阻止非特異性的擴增。為了研究不同位置堿基錯配對特異擴增的影響，分別在第2和第3位引入強錯配堿基，結(jié)果表明，第2位的錯配效果強于第3位。衛(wèi)波［20］等人研究也表明在不同位置加入錯配堿基會產(chǎn)生不同的擴增效果。

SNP分型試驗為SNP分子標記的開發(fā)利用提供技術(shù)保障，本研究通過對番茄抗枯萎病I－2基因的克隆與序列測定，利用等位基因特異PCR針對1 793位突變位點設(shè)計的特異引物及互補引物對番茄種質(zhì)資源進行了有效的分型，驗證了該標記在抗、感番茄品種間的多態(tài)性。分型設(shè)計簡單、可靠，為番茄抗枯萎病的分子標記輔助育種奠定了基礎(chǔ)。

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