胡嬌陽， 湯 鋒， 操海群＊， 花日茂， 吳祥為， 王 進， 岳永德

（1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽省農(nóng)產(chǎn)品安全重點實驗室，合肥 230036；2.國際竹藤中心，北京 100080）

新鮮水果采后病害是一個全球性的問題。據(jù)報道，發(fā)達國家有10%～30%的新鮮水果損失于采后腐爛，而在發(fā)展中國家，腐爛率高達40%～50%［1］。國內(nèi)外常用的水果采后病害的防治方法主要有低溫法、氣調(diào)法、化學(xué)殺（抑）菌劑處理等。前兩種方法投資大、能耗高、且對于病害真菌的抑制作用有限，所以目前仍然以施用化學(xué)殺菌劑為主要防治手段［2］。眾所周知，傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑的長期使用帶來了種種弊端，如植物病原菌抗藥性的產(chǎn)生、殘留毒性以及對生態(tài)環(huán)境造成的嚴重影響等［3］。隨著人們對果品質(zhì)量要求的不斷提高和環(huán)保意識的增強，公眾迫切需要在水果采后防腐保鮮過程中尋找新的病害防治劑。近年來，利用天然植物提取物來防治果實采后病害成為人們研究的熱點［4］。楊鋒波等報道了濃度為25.00mg／mL的紫莖澤蘭乙醇提取物對香焦炭疽菌、柑橘炭疽菌、疫霉的抑菌率分別為58.09%、40.34%、45.63%，其石油醚萃取部分對香蕉炭疽菌的抑菌作用最好，EC50值為0.42mg／mL［5］。楊紅等研究了丁香精油以及丁香精油－殼聚糖復(fù)合物對水果采后腐爛的主要致病真菌灰霉菌、鏈格孢、青霉菌、漿孢菌等均具有較強的抑制作用［6］。吳光旭等報道了開口箭甲醇提取物及其乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物處理荔枝果實，可明顯減輕荔枝貯藏病害的發(fā)生并能延緩其主要品質(zhì)性狀的劣變［7］。

多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），別名南黃精、山姜、野生姜，為百合科（Liliaceae）黃精屬（Polygonatum）多年生草本植物［8］。近年來國內(nèi)外的研究表明，黃精具有增強機體免疫、抗腫瘤、抗HIV、降血糖血脂和抑菌等功效［9］。鄭春艷等研究了黃精多糖對大腸桿菌、副傷寒桿菌、白葡萄球菌以及金黃色葡萄球菌等具有較強的抑制作用［10］。王冬梅等測定了卷葉黃精的正丁醇萃取物對蘋果褐腐病菌、玉米大斑病菌和棉黃萎病病原菌的抑制作用較強，EC50分別為261.26、376.03μg／mL和430.05μg／mL［11］。余紅等用氣相色譜－質(zhì)譜（GC－MS）聯(lián)用技術(shù)分析了多花黃精精油的成分，發(fā)現(xiàn)其對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、紅酵母均有較強的抑制能力［12］。蘇偉等報道了黃精多糖對金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用［13］。然而，目前有關(guān)多花黃精提取物對水果采后病原菌抑制效果方面的研究報道所見甚少。

本試驗以蘋果炭疽病菌、梨炭疽病菌、葡萄灰霉病菌和蘋果輪紋病菌等4種水果采后病原菌為對象，采用生長速率法對多花黃精不同有機溶劑提取物進行了室內(nèi)抑菌活性測定，篩選出了高活性提取物，并開展了果實上的防效驗證。研究結(jié)果將為利用多花黃精抑菌活性成分開發(fā)新型水果采后病害防治劑提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物

多花黃精（Polygonatum cyrtonema Hua），安徽省九華山黃精研究所提供，采集時間為2011年4月。

1.1.2 供試植物病原菌

蘋果炭疽病菌［Colletotrichum gloeosporioides（Penz.）Sacc.］、蘋果輪紋病菌（Botryosphaeria berengerianaf.sp.piricola Koganezawa et Sakuma）、梨炭疽 病 菌 ［Glomerella cingulata（Stonem.）Spauld.et Schrenk］、葡萄灰霉病菌（Botrytis cinerea Pers.ex Fr.）等4種水果采后病原菌，安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院植物病理學(xué)教研室提供。

1.1.3 儀器設(shè)備與試劑

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELA N－1001（日本東京理化器械株式會社）；智能型光照培養(yǎng)箱：MGC－300A（上海一恒科技儀器有限公司）；乙酸乙酯、石油醚、丙酮、無水乙醇、甲醇等均為分析純，江蘇強勝化工有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 多花黃精提取物的制備

樣品預(yù)處理：將剛采集的新鮮多花黃精根，用蒸餾水沖洗干凈，切成片，55～60℃烘干，用電動粉碎機粉碎，過40目篩，得多花黃精根粉末。

索氏提取器提?。簻蚀_稱取20g多花黃精根粉，用濾紙包實后置于250mL索氏抽提器中，分別加入甲醇、無水乙醇、丙酮、石油醚等有機溶劑浸泡過夜后，于適宜溫度（高于提取溶劑沸點10℃左右）開始提取，待提取器支管中流下的液體為無色時，即停止提?。ㄌ崛r間為2～4h）。

回流提取法提?。簻蚀_稱取50g多花黃精根粗粉，置于500mL的圓底燒瓶中，加入250mL石油醚浸泡過夜后，于（40±2）℃回流提取3～4h。

將不同方法提取液分別抽真空過濾后，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，得膏狀粗提物，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 抑菌活性的室內(nèi)毒力測定方法

采用生長速率法測定多花黃精提取物對供試菌的毒力作用。準確吸取5mL濃度為50g／L的藥液加入45mL融化培養(yǎng)基（50℃）的三角瓶中，配制成5.0g／L的含藥培養(yǎng)基，混合均勻后倒入滅菌的培養(yǎng)皿（直徑9.0cm）內(nèi)，冷卻后即為帶藥培養(yǎng)基平板。同時做相同體積的溶劑對照。在已培養(yǎng)3～4d的供試菌平板上，用直徑為0.6cm的打孔器制成若干菌餅，用接種針挑取菌餅輕放于含藥培養(yǎng)基平面上（有菌絲的一面向下）。每培養(yǎng)皿放置2個菌餅。每處理重復(fù)3次。在（28±2）℃下培養(yǎng)一定時間后，檢查各處理菌落的直徑，按下式計算不同處理對供試菌的菌絲生長抑制率。

1.2.3 對蘋果炭疽病的防效測定

1.2.3.1 保護作用

分別用濃度為50、100、150g／L的多花黃精石油醚和丙酮提取液浸泡或噴霧的方式處理果實，72h后以濃度為1×105個／mL分生孢子懸浮液針刺接種于蘋果。放置在28℃光照培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，7d后測量病斑直徑、計算防治效果，以溶劑處理后接種炭疽菌為對照。每處理3次重復(fù)，每次重復(fù)10個蘋果，每個果實接種一個點。

1.2.3.2 治療作用

用濃度1×105個／mL的分生孢子懸浮液針刺接種于蘋果，72h后分別用濃度為50、100、150g／L多花黃精石油醚和丙酮提取液采用浸泡或噴霧的方式處理接種過的果實。以1×105個／mL炭疽病菌同時接到蘋果果實上作為對照。每處理10個果實，重復(fù)3次。放置在28℃光照培養(yǎng)箱保濕培養(yǎng)，逐日觀察病斑的大小，7d后測量病斑直徑、計算防治效果。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶劑提取物的抑菌活性

用石油醚、丙酮、乙醇、甲醇等不同極性溶劑，對多花黃精進行索氏提取，不同提取溶劑的提取率差異較大，石油醚的提取率僅為0.23%，而甲醇的提取率達到31.37%。多花黃精熱水浸提的提取率為11.95%（表1）。以蘋果炭疽病菌為供試菌，不同提取溶劑提取物的抑菌活性測定結(jié)果表明，在質(zhì)量濃度為5.0g／L時，多花黃精石油醚提取物表現(xiàn)出較強的抑菌活性，72h菌絲抑制率達到73.67%；其次是丙酮提取物，菌絲抑制率達到57.67%；甲醇提取物對蘋果炭疽病的抑制效果超過了50%；無水乙醇提取物的抑菌活性最小，菌絲抑制率不超過20%，幾乎沒有抑制作用。

表1 多花黃精不同溶劑提取物對蘋果炭疽病菌的抑菌活性1）

2.2 多花黃精石油醚提取物對不同供試菌的抑菌活性

分別測定了質(zhì)量濃度為5.0g／L的多花黃精石油醚提取物對4種水果采后病原菌的抑菌活性。結(jié)果表明（表2），石油醚提取物對供試病原菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，其對蘋果炭疽病菌和梨炭疽病菌的抑制效果較好，72h菌絲抑制率分別達到73.67%和62.39%；而對葡萄灰霉病菌和蘋果輪紋病菌的菌絲生長抑制率均都小于25%，抑制作用不明顯。

表2 多花黃精石油醚提取物對供試采后病原菌的抑菌活性1）

設(shè)置系列濃度，分別測定了多花黃精石油醚提取物和丙酮提取物對蘋果炭疽病菌的抑菌活性。結(jié)果表明（表3），供試提取物的抑菌活性隨濃度的增高而增強，兩者呈顯著的正相關(guān)性。多花黃精石油醚提取物對蘋果炭疽病菌的毒力大于丙酮提取物。

表3 多花黃精提取物對蘋果炭疽病菌的毒力回歸方程1）

2.3 不同提取方法提取物的抑菌活性

以蘋果炭疽病菌為供試菌，測定了多花黃精不同提取方法提取物的抑菌活性。結(jié)果表明（表4），應(yīng)用索氏抽提法得到的多花黃精石油醚提取物的EC50值略小于回流提取的提取物。索氏提取是一種比較經(jīng)典的提取方法，提取效率較高，所得到的粗提物中抑菌有效成分含量可能相對較多。

表4 多花黃精不同提取方法提取物對供試菌的毒力回歸方程1）

2.4 不同年份多花黃精提取物的抑菌活性

將剛采集的多花黃精新鮮樣品按生長年份分類，分別經(jīng)過通風(fēng)烘干、粉碎、石油醚提取后，獲得不同年份多花黃精提取物。其對蘋果炭疽病菌72h抑菌活性測定結(jié)果表明（表5）：3年以下多花黃精提取物的抑菌活性最低，其抑菌活性隨著生長年份的延長而呈現(xiàn)出增強的趨勢，菌絲抑制率在61.69%～76.18%之間。4～6年多花黃精的抑菌活性相近。

表5 不同年份多花黃精石油醚提取物對蘋果炭疽病菌的抑制作用

2.5 多花黃精提取物對蘋果炭疽病的防治效果

結(jié)果表明（表6），多花黃精石油醚提取物對蘋果炭疽病的活體防效要強于丙酮提取物，而且保護作用明顯強于治療作用。在質(zhì)量濃度為150g／L時，多花黃精石油醚提取物對蘋果炭疽病的保護作用達到65.32%，治療作用為43.95%。

表6 多花黃精提取物對蘋果炭疽病的控制效果

3 結(jié)論與討論

研究發(fā)現(xiàn)，多花黃精不同溶劑提取物對水果采后病原菌表現(xiàn)出不同程度的抑制作用。其中，石油醚提取物抑菌活性最強，對蘋果炭疽病菌的抑制作用達到73.67%。用索氏抽提法提取的提取物對蘋果炭疽病菌的抑制作用略高于回流提取物。多花黃精隨著生長年份的延長，其提取物的抑菌活性表現(xiàn)一定的增強趨勢，但4～6年多花黃精的活性差異并不大。多花黃精石油醚提取物對蘋果炭疽病的防治效果強于丙酮提取物，保護作用明顯優(yōu)于治療作用。

目前對植物源殺菌劑的研究與開發(fā)主要集中在兩個方面：一是直接開發(fā)利用，即直接將有抑菌活性的植物加工為農(nóng)藥。二是間接開發(fā)利用，即在生物活性追蹤指導(dǎo)下，提取分離植物中的活性成分，鑒定其分子結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)先導(dǎo)化合物，進行模擬合成，從中篩選新型農(nóng)藥［14］。我國黃精屬植物有42種，占世界種類的70%左右［15］。黃精在我國已有2000多年的藥用歷史［16］。目前，黃精作為中藥資源主要利用的是黃精多糖，分布在極性部分。王冬梅等曾利用硅膠、RP－18和Sephadex LH－20等色譜分離手段從卷葉黃精根莖的正丁醇萃取物中分離得到2個甾體皂苷化合物，其對植物病原菌和細菌均有一定的抑制效果［17］。本文發(fā)現(xiàn)多花黃精提取物中弱極性部分對蘋果和梨炭疽病病原菌具有較強的抑制作用。綜合石油醚的提取率及抑制效果，直接利用提取物的成本較高，從中發(fā)現(xiàn)活性成分進行合成開發(fā)新農(nóng)藥的途徑更為適合。有關(guān)多花黃精中抑菌有效成分的純化與鑒定正在進一步研究中。

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