陳茂功， 韓志群， 林小虎， 王曉鳴＊， 周印富＊， 李洪杰

（1.河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，秦皇島 066004；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所／農(nóng)作物基因資源與基因改良國(guó)家重大科學(xué)工程，北京 100081）

在中國(guó)，玉米彎孢葉斑病是由新月彎孢［Curvularia lunata（Wakker）Boedijn］引起的一種葉部病害，目前幾乎在各玉米種植地區(qū)都有發(fā)生，一度成為北方地區(qū)主要葉部病害之一，并在遼寧西部地區(qū)引起嚴(yán)重的生產(chǎn)損失［1］。目前對(duì)病菌的研究主要集中在致病性分化、變異與致病機(jī)制等方面［2］，但對(duì)其在玉米葉片上的侵染及發(fā)育過(guò)程尚不十分清楚。

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化（Agrobacteriumtume faciens－mediated transformation，ATMT）是近年來(lái)被廣泛應(yīng)用的一種真菌轉(zhuǎn)化技術(shù)，其免除了聚二乙醇（polyethylene glycol，PEG）介導(dǎo)和限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合（restriction enzyme－mediated integration，REMI）等轉(zhuǎn)化方法中原生質(zhì)體制備的復(fù)雜過(guò)程，具有轉(zhuǎn)化效率高、易獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子和T－DNA在真菌基因組中以單拷貝插入為主等優(yōu)點(diǎn)［3］。自1998年de Groot等首次將ATMT法應(yīng)用于絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化以來(lái)，已有大量的絲狀真菌通過(guò)ATMT法成功實(shí)現(xiàn)了遺傳轉(zhuǎn)化［4］。目前，ATMT技術(shù)也被用于彎孢菌的遺傳轉(zhuǎn)化、基因定點(diǎn)突變和功能研究［5］。紅色熒光蛋白（DsRed）來(lái)源于?？w內(nèi)的非常穩(wěn)定的生物發(fā)光蛋白。DsRed和綠色熒光蛋白（GFP）具有相似的產(chǎn)生熒光機(jī)理，但DsRed的熒光信號(hào)能夠在組織中更加充分地轉(zhuǎn)換，其波長(zhǎng)比GFP的長(zhǎng)并具較高的噪音比，更易觀察。DsRed作為新一代報(bào)告基因，已經(jīng)被用于果蠅、細(xì)菌、真菌、黏菌的標(biāo)記研究［6－15］。在我國(guó)，DsRed 基因也被用于魚(yú)、酵母、病毒以及植物致病真菌等的研究中［16－20］。

本研究以hygB抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，采用ATMT法將DsRed熒光蛋白基因整合入新月彎孢基因組中，實(shí)現(xiàn)新月彎孢的DsRed標(biāo)記，并對(duì)TDNA插入突變體的主要表型特征進(jìn)行鑒定，檢測(cè)基因的插入位點(diǎn)，為進(jìn)一步的新月彎孢研究進(jìn)行技術(shù)準(zhǔn)備。

1 材料和方法

1.1 供試菌株、質(zhì)粒和植物材料

分離自玉米的新月彎孢（C.lunata）由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所保存；攜帶DsRed基因的質(zhì)粒pCAMDsRed由 Marina Franceschetti（John Inner Center，UK）惠贈(zèng)。DsRed基因受構(gòu)巢曲霉3－磷酸甘油醛脫氫酶基因gpdA的啟動(dòng)子PgpdA調(diào)控，以潮霉素B抗性基因hyg作為選擇標(biāo)記基因［21］；高感彎孢葉斑病的玉米自交系‘黃早四’用于病菌致病力檢測(cè)。

1.2 農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化

通過(guò)對(duì)含潮霉素B濃度為0、30、50、75、100μg／mL和150μg／mL的PDA平板上新月彎孢生長(zhǎng)狀況的檢測(cè)，確定野生型C.lunata對(duì)潮霉素B的耐受濃度為50μg／mL。

參照Mullins等的方法［22］，進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)下DsRed基因?qū)隒.lunata的操作。獲得轉(zhuǎn)化子菌落后，挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子至含抗生素（頭孢霉素200μg／mL和潮霉素B 50μg／mL）的PDA平板上，待菌株長(zhǎng)滿全皿且產(chǎn)孢后，用無(wú)菌水洗下孢子，并稀釋至1.0×102個(gè)／mL，取100μL孢子懸浮液均勻涂布到含潮霉素B 50μg／mL的PDA平板上，25℃培養(yǎng)2d后挑取單菌落，獲得單孢純化菌株。

1.3 轉(zhuǎn)化子熒光觀察及標(biāo)記檢測(cè)

在熒光顯微鏡（Olympus BX41，日本）下觀察轉(zhuǎn)化子的紅色熒光表達(dá)。檢測(cè)DsRed基因和hyg基因整合結(jié)果時(shí)，采用CTAB法提取菌株DNA，以DsRed 基因引物（DsRed－F：5′－ACTCCTCCGAGGACGTCATCAA－3′；DsRed－R：5′－ACGTAGTGTAGTAGCCGGGCAGCT－3′）和潮霉素B抗性hyg基 因 引 物 （Hyg－8F：5′－GCAGACAGGAACGAGGACAT－3′； Hyg－8R： 5′－GCTCCATACAAGCCAACCAC－3′）進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)物以0.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。潮霉素B抗性基因的Southern blotting分析根據(jù)試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行。

1.4 轉(zhuǎn)化子致病性相關(guān)性狀測(cè)定

將轉(zhuǎn)化子和野生型菌株用直徑4mm的打孔器打菌餅接于PDA平板上，25℃恒溫黑暗培養(yǎng)5d，測(cè)定菌絲生長(zhǎng)速率；產(chǎn)孢量測(cè)定參照賀春萍等人的方法［23］。將轉(zhuǎn)化子及野生型菌株接種液體培養(yǎng)基（參照 Marcus等配制［24］）中，25℃恒溫培養(yǎng)15d，每天120r／min振蕩1h。將培養(yǎng)液經(jīng)雙層紗布過(guò)濾，過(guò)濾液轉(zhuǎn)入離心管，在4℃，10 000r／min高速離心，上清液即為酶提取液。纖維素酶系中的內(nèi)切β－1，4－葡聚糖酶（Cx酶）活性測(cè)定參照 Lee等方法［25］；果膠酶中的聚甲基半乳糖醛酸酶（polymethylgalacturonase，PMG）活性測(cè)定參照 Murata等方法［26］；粗毒素的提取參照唐樹(shù)戈等方法［27］，毒素生物測(cè)定所用離體葉片針刺法參照康紹蘭等［28］，毒素致病性分析設(shè)3次重復(fù)，測(cè)定獨(dú)立進(jìn)行2次。

1.5 轉(zhuǎn)化子的致病性測(cè)定

在自交系‘黃早四’4葉期時(shí)，采用毛筆涂抹法接種葉片，轉(zhuǎn)化子接種懸浮液中分生孢子濃度為1.0×106個(gè)／mL，接種后黑暗保濕36h，然后放置溫室（25℃）中正常管理。分別以無(wú)病菌接種液和野生型孢子接種液為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。接種5d后觀察葉片發(fā)病率并計(jì)算病情指數(shù)，方法參照李金堂等［29］。玉米植株、營(yíng)養(yǎng)土及所用儀器用完后進(jìn)行滅菌處理。

1.6 轉(zhuǎn)化子的初步應(yīng)用

將Cl－DsRed 4轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接至含有50μg／mL潮霉素B的PDA平板，25℃培養(yǎng)7d，用無(wú)菌水洗下孢子鏡檢并將菌液稀釋至1.0×106個(gè)／mL，取400μL置于凹形載玻片的凹槽中，25℃黑暗保濕培養(yǎng)12h后在熒光顯微鏡下觀察孢子萌發(fā)的形態(tài)；將該孢子懸浮液接種‘黃早四’的葉片，黑暗保濕36h后放置溫室正常管理，4d后取葉片病斑處觀察菌絲侵染情況。

1.7 DsRed基因插入位點(diǎn)側(cè)翼序列分析

突變體T－DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的擴(kuò)增采用TAIL－PCR，參照 Liu等［30］和徐榮旗等［31］的方法進(jìn)行。膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，連接到pGM－T載體中轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)，篩選陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。引物合成（表1）和測(cè)序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

表1 hiTAIL－PCR擴(kuò)增T－DNA插入位點(diǎn)側(cè)翼序列引物列表1）

2 結(jié)果與分析

2.1 新月彎孢的遺傳轉(zhuǎn)化與熒光表達(dá)特點(diǎn)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將DsRed基因整合至新月彎孢基因組中，獲得紅色熒光蛋白基因標(biāo)記的菌株Cl－DsRed 1、Cl－DsRed 2、Cl－DsRed 3和 Cl－DsRed 4。利用DsRed和hyg基因特異性引物從4個(gè)轉(zhuǎn)化子基因組DNA中均擴(kuò)增獲得579bp和800bp目的片段，質(zhì)粒pCAMDsRed中也能擴(kuò)增出相同片段，而野生型菌株中無(wú)擴(kuò)增（圖1a，b），表明DsRed基因已轉(zhuǎn)入新月彎孢基因組中。Southern blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，4個(gè)轉(zhuǎn)化子分別出現(xiàn)位置不同的單一條帶，表明轉(zhuǎn)化子為T－DNA單拷貝插入，插入位點(diǎn)不同，無(wú)明顯的位點(diǎn)插入偏好（圖1c）。

圖1 轉(zhuǎn)化子中DsRed基因（a）和hyg基因（b）的PCR檢測(cè)與Southern雜交分析（c）

雖然轉(zhuǎn)化子外觀形態(tài)與野生型相同，但在熒光顯微鏡紫外光激發(fā)下，轉(zhuǎn)化子菌絲、分生孢子梗和分生孢子能發(fā)出明亮的紅色熒光（圖2a，b），而野生型無(wú)熒光表達(dá)（圖2c，d）。DsRed基因只在轉(zhuǎn)化子分生孢子原生質(zhì)中表達(dá)而在孢子壁和隔膜中無(wú)表達(dá)（圖2e），分生孢子成熟后由于孢子壁加厚導(dǎo)致熒光減弱。對(duì)4個(gè)轉(zhuǎn)化子在普通PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)5代后，重新轉(zhuǎn)接至含潮霉素B的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化子仍能夠正常生長(zhǎng)，PCR檢測(cè)能夠擴(kuò)增出目的片段，表明DsRed基因在轉(zhuǎn)化子中穩(wěn)定遺傳。

2.2 轉(zhuǎn)化子致病相關(guān)性狀的改變

差異顯著性分析表明，轉(zhuǎn)化子Cl－DsRed 2的生長(zhǎng)速度極顯著低于野生型菌株，其他轉(zhuǎn)化子無(wú)顯著差異；轉(zhuǎn)化子Cl－DsRed 3產(chǎn)孢量極顯著減少，Cl－DsRed 1的產(chǎn)孢量也受到一定程度的影響。各轉(zhuǎn)化子Cx酶均略有下降，但差異不顯著。而菌株間PMG 酶活性差異明顯，轉(zhuǎn)化子 Cl－DsRed 1、Cl－DsRed 2和Cl－DsRed 4的活性顯著高于野生型菌株，而Cl－DsRed 3則表現(xiàn)為下降。轉(zhuǎn)化子Cl－DsRed 3粗毒素的致病力極顯著下降，其他轉(zhuǎn)化子粗毒素的致病力也受到一定影響（表2）。

圖2 轉(zhuǎn)化子Cl－DsRed 4菌株的熒光表達(dá)

表2 轉(zhuǎn)化子致病相關(guān)性狀的比較分析1）

2.3 轉(zhuǎn)化子對(duì)玉米的致病性

Cl－DsRed 1、Cl－DsRed 2和Cl－DsRed 4與野生型菌株一樣，在感病自交系‘黃早四’的葉片上表現(xiàn)出較強(qiáng)的毒性和侵襲力，在接種后3d即可產(chǎn)生典型病斑；Cl－DsRed 3在接種5d后才出現(xiàn)典型病斑且病斑面積小，表明其侵襲力和致病力有所減弱。

2.4 轉(zhuǎn)化子的初步應(yīng)用

新月彎孢為半知菌亞門絲孢綱絲孢目暗色絲孢科彎孢屬的真菌，分生孢子具3個(gè)隔橫4細(xì)胞，中隔常位于中央偏下處，從莖部數(shù)第3個(gè)細(xì)胞膨大；在黑暗培養(yǎng)12h后，孢子萌發(fā)率達(dá)到95%以上，一般從兩端顏色較淡的細(xì)胞長(zhǎng)出芽管，少許孢子單端萌發(fā)；接種Cl－DsRed 4后5d，自交系‘黃早四’葉片上形成梭形褪綠透明的病斑（圖2f）。在熒光顯微鏡下，能夠看到紅色熒光蛋白在病菌侵染玉米葉片菌絲中的表達(dá)（圖2g）。

2.5 DsRed基因轉(zhuǎn)化子插入位點(diǎn)分析

在7個(gè)簡(jiǎn)并引物中，AD5最適合彎孢菌的TAIL－PCR擴(kuò)增，4個(gè)轉(zhuǎn)化子中有3個(gè)獲得特異性條帶，致病力表現(xiàn)下降的Cl－DsRed 3未獲得側(cè)翼序列，其他簡(jiǎn)并引物未產(chǎn)生特異性擴(kuò)增。將所獲得的序列提交NCBI后采用blastn比對(duì)，未發(fā)現(xiàn)高度同源的基因序列。初步比對(duì)結(jié)果（表3）表明，在Cl－DsRed 1轉(zhuǎn)化子中，DsRed蛋白編碼基因插入在一個(gè)未知功能的假定蛋白（939bp）中，但有效比對(duì)區(qū)域僅為216bp，插入位點(diǎn)為該假定蛋白基因的575和576位堿基之間。Cl－DsRed 2轉(zhuǎn)化子的DsRed蛋白編碼基因插入在ATP核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶編碼基因（1 252bp）中，有效比對(duì)區(qū)域?yàn)?73～583bp大小，插入位點(diǎn)為該基因的227和228位堿基之間。Cl－DsRed 2轉(zhuǎn)化子在菌絲生長(zhǎng)速度和PMG酶活性方面表現(xiàn)出與野生型菌株的極顯著差異，可能與ATP核糖磷酸轉(zhuǎn)移酶活性受到干擾有關(guān)。Cl－DsRed 4轉(zhuǎn)化子的側(cè)翼序列未發(fā)現(xiàn)有登錄的相似基因序列。

表3 側(cè)翼序列基因的比對(duì)

3 討論

作為生物學(xué)研究工具，DsRed已對(duì)許多真菌成功實(shí)現(xiàn)了標(biāo)記，但對(duì)玉米彎孢葉斑病菌的遺傳標(biāo)記國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，將紅色熒光蛋白標(biāo)記基因插入新月彎孢基因組DNA中，獲得了DsRed基因穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)化子，為該病菌在寄主植物中的侵染循環(huán)和致病機(jī)制研究提供了重要的材料。

對(duì)轉(zhuǎn)化子表型測(cè)定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化子與野生型相比，在一些性狀方面出現(xiàn)改變，可能是外源DNA片段的隨機(jī)插入位點(diǎn)影響了相關(guān)基因的表達(dá)，產(chǎn)生的突變體可用以研究彎孢菌生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因和致病基因。在獲得的4個(gè)轉(zhuǎn)化子中，Cl－DsRed 4與野生型在致病性和其他性狀方面相近，適用于彎孢菌與玉米互作的研究。但由于玉米葉片自身紅色熒光較強(qiáng)，直接在葉表觀察彎孢菌絲的擴(kuò)展、入侵等特征較為困難，只有在葉片橫切面才能有效觀察到發(fā)熒光菌絲。因此需要其他技術(shù)手段消除葉片自身熒光而不影響病菌熒光的觀察，以便能夠檢測(cè)到彎孢菌對(duì)玉米葉片的完整侵染循環(huán)過(guò)程。

hiTAIL－PCR技術(shù)可以通過(guò)對(duì)插入位點(diǎn)側(cè)翼序列的分析確定基因插入的位置，從而分析該基因功能與表型突變之間的關(guān)系［31］。本試驗(yàn)還對(duì)其他20個(gè)突變體的插入位點(diǎn)側(cè)翼序列進(jìn)行了擴(kuò)增，獲得了其中13個(gè)序列，從本文的側(cè)翼序列比對(duì)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，具有相似性的登錄基因序列均來(lái)自與新月彎孢相近分類學(xué)地位的子囊菌格孢腔菌科（Pleosporace－ae）真菌：偃麥草核腔菌［Pyrenophora tritici－repentis（Died.）Drechsler］、圓核腔菌（Pyrenophora teres f.teres）、穎枯暗球腔菌（Phaeosphaeria nodorum）（無(wú)性態(tài)：斑污小球腔菌Leptosphaeria maculans），表明格孢腔菌科真菌在基因組成方面具有相似性。

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