劉欣偉，馮雅麗，李浩然，蔡震雷，楊志超

(1. 北京科技大學(xué) 土木與環(huán)境工程學(xué)院, 北京 100083；2. 中國科學(xué)院 過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190)

鎂離子濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長動力學(xué)的影響

劉欣偉1，馮雅麗1，李浩然2，蔡震雷1，楊志超1

(1. 北京科技大學(xué) 土木與環(huán)境工程學(xué)院, 北京 100083；2. 中國科學(xué)院 過程工程研究所生化工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100190)

在氧化亞鐵硫桿菌(T. f)培養(yǎng)過程中其他營養(yǎng)物質(zhì)足量的情況下，通過考察不同初始Mg2+濃度對氧化亞鐵硫桿菌(T. f)生長活性的影響，得到在不同Mg2+濃度下細(xì)菌的生長曲線。結(jié)果表明：T. f對Mg2+具有一定的耐受能力；當(dāng)培養(yǎng)基中ρ(Mg2+)≤10 g/L時(shí)，Mg2+對細(xì)菌生長活性影響很小；其ρ(Mg2+)為15 g/L時(shí)，Mg2+開始產(chǎn)生延遲效應(yīng)，抑制細(xì)菌生長；ρ(Mg2+)為20 g/L時(shí)，細(xì)菌生長完全受到抑制。同時(shí)利用基于存在非競爭性抑制的Monod方程，建立了T. f在高M(jìn)g2+濃度下的生長動力學(xué)方程模型，確定在不同條件下細(xì)菌生長動力學(xué)參數(shù)，包括最大比生長速率μmax、Monod常數(shù)Km及鎂離子抑制常數(shù)KI。利用correl系數(shù)工具分析細(xì)菌比生長速率的實(shí)驗(yàn)值和模擬值之間的相關(guān)系數(shù)為 0.973，表明該動力學(xué)方程能較好地描述Mg2+濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長的影響。

氧化亞鐵硫桿菌；生長動力學(xué)；非競爭性抑制；比生長速率

Abstract:When the other nutrients were sufficient in the culture ofThiobacillus ferrooxidans, the impact of the different initial Mg2+concentration on the activity of the growth ofThiobacillus ferrooxidanswas studied, and the bacterial growth curves were obtained at different magnesium ion concentrations. The results of the experiment show thatThiobacillus ferrooxidansis tolerant to Mg2+some extent. No bad effect on the growth and activity ofThiobacillus ferrooxidansby Mg2+is brought when cultured in 9K medium containingρ(Mg2+)≤10 g/L. The growth and activity ofThiobacillus ferrooxidansare obviously influenced by Mg2+whenρ(Mg2+) is 15 g/L. When the concentration of Mg2+is around 20 g/L,the growth and activity ofThiobacillus ferrooxidansare completely inhibited. Simultaneously the kinetic model for the growth ofThiobacillus ferrooxidansat high magnesium ion concentrations is deduced on the basis of the non-competitive inhibition of the Monod equation. The values of kinetic parameters (i.e. maximum growth rateμmax, Monod constantKmand magnesium ion inhibition constantKI) under different initial experiment conditions are determined. The correlation coefficient between the simulated and experiment specific growth rates is 0.973, which shows that the kinetics equation can well describe the effect of magnesium ion concentration on the growth ofThiobacillus ferrooxidans.

Key words:Thiobacillus ferrooxidans; growth kinetics; non-competitive inhibition; specific growth rate

隨著高品位鎳礦資源的減少, 低品位鎳礦資源目前進(jìn)入開發(fā)回收階段[1]。從低品位礦中回收鎳是我國保證鎳資源供應(yīng)的基礎(chǔ)保證[2?3]。我國金川公司(JNMC)擁有約400 Mt低品位硫化鎳礦，平均鎳品位為 0.60%，是典型的高鎂型低品位硫化鎳礦。由于高昂的成本和日趨嚴(yán)緊的環(huán)保要求，采用處理富礦的生產(chǎn)工藝處理這些貧礦是不可行的。本文作者針對金川高鎂型低品位硫化鎳礦的氧化亞鐵硫桿菌(T. f)浸出工藝進(jìn)行研究，由于該礦的主要脈石礦物為含鎂高的蛇紋石及綠泥石，在細(xì)菌浸出過程中部分Mg2+進(jìn)入溶液中。Mg2+對于細(xì)菌生長是必需的，但是當(dāng)Mg2+超過細(xì)菌生長耐受范圍時(shí)，過高的滲透壓會導(dǎo)致細(xì)菌死亡。Mg2+對T. f生長活性的影響，國內(nèi)外已有文獻(xiàn)報(bào)道[4?6]，但從動力學(xué)[7?10]方面考察Mg2+濃度對T. f生長動力學(xué)的影響尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。

在此，本文作者旨在通過監(jiān)測高M(jìn)g2+濃度培養(yǎng)條件下的T. f菌生長過程，利用存在非競爭性抑制的Monod模型[11]，得到高鎂濃度培養(yǎng)條件下的T. f菌生長動力學(xué)方程，以期對利用T. f浸出高鎂型低品位硫化鎳礦的生產(chǎn)實(shí)踐起到一定的指導(dǎo)作用。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 培養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)用菌種氧化亞鐵硫桿菌(T. f)，實(shí)驗(yàn)室保藏。在高鎂離子濃度下經(jīng)馴化后，用于實(shí)驗(yàn)。

培養(yǎng)基為9K培養(yǎng)基，Mg2+采用MgSO4·7H2O(化學(xué)純)配置，培養(yǎng)溫度為30～32 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為120 h，接種濃度為1×107/mL，接種量為10%，顯微鏡記數(shù)。

培養(yǎng)方式如下：在250 mL錐形瓶中裝入按上述條件配置的100 mL培養(yǎng)液，置于SZX?B型恒溫水浴振蕩搖床內(nèi)，用DZS?707型多參數(shù)分析儀測定溶液氧化還原電位(φ)，定期補(bǔ)加蒸餾水彌補(bǔ)損耗的水分。

1.2 不同 Mg2+濃度下氧化亞鐵硫桿菌生長曲線的測定

測定細(xì)菌的生長曲線對掌握高鎂離子濃度下細(xì)菌生長規(guī)律很重要。實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)代培養(yǎng)后的細(xì)菌分別接入初始ρ(Mg2+)=0.004 9～20 g/L、初始pH=1.8的培養(yǎng)基中，菌種濃度為1×107/mL，接種量為10%。定期測定培養(yǎng)基中的細(xì)菌數(shù)、亞鐵離子濃度ρ(Fe2+)及三價(jià)鐵離子濃度ρ(Fe3+)。

1.3 主要儀器及分析方法

主要儀器如下：722型光柵分光光度計(jì)；pHS?29A型酸度計(jì)；DZS?707型多參數(shù)分析儀；SZX?B型恒溫水浴振蕩搖床；XS?18電子顯微鏡。

分析方法如下：Fe2+和總鐵分析采用鄰菲啰啉分光光度法測定，F(xiàn)e3+的量由總鐵和Fe2+的量之差確定；細(xì)菌活體數(shù)采用血球計(jì)數(shù)法測定；溶液的氧化還原電位用DZS?707型多參數(shù)分析儀測定。

1.4 生長動力學(xué)模型

綜合氧化亞鐵硫桿菌的生長動力學(xué)模型，本文作者選擇一種存在非競爭性抑制的 Monod方程[11]。該方程表達(dá)形式簡單，有利于工業(yè)應(yīng)用，其公式如下：

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 氧化亞鐵硫桿菌生長過程中代謝變化

通過改變培養(yǎng)基中Mg2+濃度(0.004 9 g/L(基礎(chǔ)培養(yǎng)基)，5，10，15和20 g/L)，對T. f菌生長過程的代謝變化進(jìn)行研究，得到細(xì)胞濃度，亞鐵濃度ρ(Fe2+)及三價(jià)鐵濃度ρ(Fe3+)隨時(shí)間的變化曲線如圖1所示。

研究結(jié)果表明，適當(dāng)增加培養(yǎng)基中Mg2+含量有利于細(xì)菌生長；當(dāng)ρ(Mg2+)≤10 g/L時(shí)，Mg2+對細(xì)菌生長活性影響很小，不影響細(xì)菌的生長繁殖；但當(dāng)溶液中Mg2+濃度升至15 g/L時(shí)，開始產(chǎn)生延遲效應(yīng)，抑制細(xì)菌生長；當(dāng)溶液中Mg2+濃度升至20 g/L時(shí)，細(xì)菌的生長繁殖完全停止，菌體開始死亡。MgSO4是細(xì)菌培養(yǎng)基的主要成分，它對細(xì)菌細(xì)胞的結(jié)構(gòu)如核糖體、細(xì)胞膜等的穩(wěn)定性起重要作用。但隨著 Mg2+質(zhì)量濃度的升高，體系的滲透壓增大，會影響細(xì)菌正常的生理功能。細(xì)菌調(diào)節(jié)體內(nèi)Mg2+濃度的能力是有限的，因此，Mg2+濃度過高會造成細(xì)菌生長停滯甚至死亡。在已有文獻(xiàn)所得T. f菌的生長動力學(xué)方程中，普遍認(rèn)同金屬離子對T. f菌生長的非競爭性抑制[12?13]，在本實(shí)驗(yàn)中以此為基礎(chǔ)建立動力學(xué)方程。

2.2 不同Mg2+濃度對溶液氧化還原電位(φ)的影響

試驗(yàn)在Mg2+濃度為0.004 9～20 g/L范圍內(nèi)考察了溶液氧化還原電位φ的變化情況，結(jié)果如圖2所示。

細(xì)菌生長過程中，溶液中主要發(fā)生的反應(yīng)如下：

根據(jù)能斯特方程和反應(yīng)式中各物質(zhì)的熱力學(xué)數(shù)據(jù)，計(jì)算溶液中的氧化還原電位如式(4)

式(4)表明隨著T. f菌將溶液中的Fe2+氧化為Fe3+，F(xiàn)e3+濃度增加，ρ(Fe3+)/ρ(Fe2+)比值增加，導(dǎo)致溶液氧化還原電位φ上升。由圖2可知，當(dāng)ρ(Mg2+)≤10 g/L時(shí)，溶液中最大氧化還原電位φ基本不變，為610 mV，表明細(xì)菌活性受 Mg2+影響很小，菌體生長旺盛；當(dāng)Mg2+濃度從10 g/L增加到20 g/L時(shí)，溶液中最大氧化還原電位φ由610 mV降低至392 mV，這也可由圖1結(jié)果得到解釋，隨著Mg2+濃度增加，抑制了T. f菌的生長，導(dǎo)致對鐵的氧化能力降低，溶液中ρ(Fe3+)/ρ(Fe2+)

比值隨Mg2+濃度的增加而降低，根據(jù)式(4)進(jìn)行計(jì)算，φ值減小，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此相符。

圖2 Mg2+濃度對培養(yǎng)液氧化還原電位的影響Fig.2 Impact of Mg2+concentration on culture solution redox potential

2.3T. f菌生長動力學(xué)參數(shù)的確定

為確定不同 Mg2+濃度下細(xì)菌生長的最大比生長速率μmax、Monod飽和常數(shù)KM、Mg2+抑制常數(shù)KI的值，參考 GABRIEL[14]和 LIU[15]求解動力學(xué)方程的方法進(jìn)行了相關(guān)參數(shù)的求解。

細(xì)菌比生長速率μ利用兩點(diǎn)法[16]求解，其滿足如下方程：

式中：X為溶液中細(xì)胞的數(shù)目；t為時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)采用等間隔取點(diǎn)分析，綜合式(5)可簡化為

動力學(xué)模型(2)可變形為

不同Mg2+濃度下T. f菌比生長速率和動力學(xué)參數(shù)的求解曲線如圖3所示。

通過1/μ?1/ρ(Fe2+)作圖，曲線y截距為1/μ′max，x截距為?1/KM，從而求得μ′max、KM。從曲線求解所得動力學(xué)模型(2)中細(xì)菌生長的動力學(xué)參數(shù)值見表1。

在T. f菌最常用的9K培養(yǎng)基中，MgSO4是不可缺少的主要成分之一，一般含Mg2+0.005 g/L左右，

因此可認(rèn)為μmax=μ′max=0.192 h?1。

(1)的各動力學(xué)參數(shù)如表2。

表1 細(xì)菌生長動力學(xué)參數(shù)值Table 1 Kinetic parameters for growth of bacterium

表2 氧化亞鐵硫桿菌生長動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters for growth of Thiobacillus ferrooxidans

圖3中各曲線的相關(guān)性較好，R2都大于0.97，證明所得動力學(xué)參數(shù)較好地符合了實(shí)驗(yàn)結(jié)果。由表2可知，KM值基本不變，這與抑制劑對酶催化反應(yīng)速率的非競爭性抑制中KM值保持恒定的結(jié)論相符[11]。而KI和μmax均有不同程度的變化，這一結(jié)果與實(shí)驗(yàn)選擇的高M(jìn)g2+濃度條件有關(guān)。KI值的大小表示細(xì)菌對Mg2+的吸收親和力的大小，隨著Mg2+濃度的增加，細(xì)菌對Mg2+的親和力增大，導(dǎo)致Mg2+的非競爭性抑制作用也相應(yīng)增加，KI值減小。μmax表示T. f菌的最大比生長速率，隨著Mg2+濃度的增加，Mg2+逐漸與酶活性中心以外的基團(tuán)結(jié)合，故Mg2+與底物Fe2+兩者沒有競爭作用，但是由于Mg2+的結(jié)合可導(dǎo)致酶活性中心的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變(見圖 4)，消弱了底物 Fe2+和酶活性中心的結(jié)合，導(dǎo)致最大反應(yīng)速率μmax的減小。

Mg2+濃度越高，形成不能轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的EI或IES越多，KI值越小，μmax降低的程度也越顯著，非競爭性抑制的反應(yīng)機(jī)理可用式(8)表示。由于μmax降低，酶的反應(yīng)速率也相應(yīng)減小。非競爭性抑制作用的強(qiáng)弱取決于抑制物的絕對濃度，因而不能用增大底物濃度的辦法來消除此種抑制作用。

圖3 不同Mg2+濃度下T. f菌的比生長速率和動力學(xué)求解曲線Fig.3 Specific growth rate of T. f ((a),(b), (c), (d)) and dynamic processing curves ((a′), (b′), (c′), (d′)) at different Mg2+concentrations: (a), (a′) 0.004 9 g/L (basic medium); (b), (b′) 5 g/L; (c), (c′) 10 g/L; (d), (d′) 15 g/L

圖4 非競爭性抑制示意圖Fig.4 Schematic diagram of non-competitive inhibition

為了描述鎂離子濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長動力學(xué)的影響，在動力學(xué)模型中引入初始鎂離子濃度項(xiàng)ρ0和初始飽和常數(shù)KI0，動力學(xué)方程(1)可變形為

根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過對μmax與KI的試差，得到氧化亞鐵硫桿菌在Mg2+濃度為0～15 g/L范圍內(nèi)的生長動力學(xué)方程，如式(10)所示：

利用correl系數(shù)工具分析理論值與實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)系數(shù)為0.973，見圖5。該值表明以上動力學(xué)方程能較好地描述鎂離子濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長的影響。

圖5 比生長速率實(shí)驗(yàn)室與模擬值的比較Fig.5 Comparison of laboratory and simulated values about specific growth rate

3 結(jié)論

1) 考察了在不同 Mg2+濃度下，氧化亞鐵硫桿菌的細(xì)菌濃度、ρ(Fe2+)、ρ(Fe3+)和溶液氧化還原電位φ隨時(shí)間的變化，結(jié)果表明氧化亞鐵硫桿菌(T. f)對Mg2+具有一定的耐受能力；當(dāng)培養(yǎng)基中ρ(Mg2+)≤10 g/L時(shí)，Mg2+對細(xì)菌的生長活性影響很??；ρ(Mg2+)為 15 g/L時(shí)，開始產(chǎn)生延遲效應(yīng)，抑制細(xì)菌生長；ρ(Mg2+)為20 g/L時(shí)，細(xì)菌生長完全受到抑制，并且隨著Mg2+濃度的增加，溶液氧化還原電位φ逐漸減小。

2) 利用基于存在非競爭性抑制的 Monod方程，建立了T. f菌在高鎂濃度下的生長動力學(xué)方程模型，得到了4個Mg2+濃度下細(xì)菌生長的動力學(xué)參數(shù)值，結(jié)果表明，隨著Mg2+濃度的增加，非競爭性抑制作用增加，消弱了底物Fe2+與酶活性中心的結(jié)合，KI和μmax逐漸減小，這也說明在一定Mg2+濃度下，氧化亞鐵硫桿菌才能正常生長。

3) 對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)推導(dǎo)，得出該菌種在Mg2+濃度為0～15 g/L范圍內(nèi)的生長動力學(xué)方程：

利用該方程得到的比生長速率理論值與實(shí)驗(yàn)值的相關(guān)系數(shù)為 0.973，表明該方程能較好地描述Mg2+濃度對氧化亞鐵硫桿菌生長情況的影響。

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(編輯 龍懷中)

Effect of magnesium ion concentration on growth kinetics of Thiobacillus ferroxidans

LIU Xin-wei1, FENG Ya-li1, LI Hao-ran2, CAI Zhen-lei1, YANG Zhi-chao1
(1. School of Civil and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing,Beijing 100083, China;2. State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering,Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China)

Q935

A

1004-0609(2012)08-2353-07

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20876160)

2011-07-20；

2011-11-20

馮雅麗, 教授，博士；電話：010-62311181；E-mail: ylfeng126@126.com