張東亞 楊苗苗 楊改清 毛興愛

1）鄭州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州 450000 2）鄭州市衛(wèi)校內(nèi)科學(xué)教研室 鄭州 450000 3）新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 新鄉(xiāng) 453100

缺血性腦血管病是目前嚴(yán)重威脅人類健康的疾病之一，是高致死率、高致殘率疾病，且其發(fā)病率、患病率、死亡率呈上升趨勢(shì)。其損傷機(jī)制的研究正逐步深入，多數(shù)研究表明，補(bǔ)體C3的活化和裂解后啟動(dòng)和放大了補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)，其產(chǎn)生的系列補(bǔ)體活性成分參與了缺血性腦損害的病理生理過程，它們可直接和間接引起一系列中間炎癥反應(yīng)引起腦組織損傷［1］。補(bǔ)體C3在腦缺血的病理生理過程中起著關(guān)鍵作用。亞低溫（32～35℃）對(duì)腦缺血的腦保護(hù)作用已得到大多數(shù)學(xué)者的認(rèn)可，但目前尚未見有關(guān)亞低溫與C3關(guān)系的報(bào)道。本研究通過建立大腦中動(dòng)脈閉塞模型觀察亞低溫對(duì)局灶性腦缺血大鼠C3表達(dá)的影響。探討亞低溫對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制。為亞低溫的臨床應(yīng)用提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 3月齡健康雄性Sprague－Dawley大鼠100只，體質(zhì)量250～300g，新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。兔抗大鼠C3抗體，即用型SABC免疫組化染色試劑盒，DAB顯色試劑盒，均由武漢博士德生物工程有限公司提供。

1.2動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組及MCAO模型建立將大鼠隨機(jī)分成3組：假手術(shù)組20只，常溫組40只，亞低溫組40只，各組又根據(jù)觀察時(shí)間點(diǎn)分為5個(gè)亞組，即腦缺血6h、1d、2d、3d、7d五個(gè)亞組。假手術(shù)各亞組4只，亞低溫和常溫各亞組8只。采用Zea Longa法制作改進(jìn)的大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞模型，模型成功的標(biāo)志是大鼠清醒后出現(xiàn)左側(cè)Horner征和右側(cè)前肢為重的偏癱。用電子溫度計(jì)監(jiān)測(cè)肛溫，采用燈泡升溫、冰袋降溫的方法控制溫度。常溫組和假手術(shù)組：固定在常溫操作臺(tái)上6h，保持肛溫（37℃±0.5℃）左右。亞低溫組：（1）降溫：線栓插入成功并固定后，迅速縫合切口，開始進(jìn)行亞低溫干預(yù)，將冰塊置于大鼠的頭部、頸部、肩部及軀干兩側(cè)，十分鐘內(nèi)使肛溫降至（33℃±1℃），維持低溫6h。（2）復(fù)溫：撤去冰塊，使體溫自然恢復(fù)正常。測(cè)溫完畢，動(dòng)物蘇醒后放歸室溫為25℃的動(dòng)物房?jī)?nèi)單籠喂養(yǎng)，給予普通飲用水及食物。

1.3神經(jīng)功能缺失評(píng)分采用神經(jīng)缺陷評(píng)分（zealonga five point scale，ZFPS）進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)定：0分，無神經(jīng)缺損癥狀；1分，不能伸展對(duì)側(cè)前爪；2分，行走時(shí)向偏癱側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向偏癱側(cè)傾倒；4分，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。1～3分納入實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，0分或4分為排除標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 標(biāo)本采集、固定、HE染色及C3免疫組化染色 各時(shí)間點(diǎn)各組的每只大鼠用10%水合氯醛0.3mL／100g麻醉后，經(jīng)左心室依次灌注生理鹽水100mL，10%多聚甲醛溶液400mL進(jìn)行前固定后，快速斷頭取出大腦，所有大鼠取腦后均觀察顱底有無凝血塊、顱底動(dòng)脈環(huán)有無血栓形成，排除蛛網(wǎng)膜下腔出血和繼發(fā)性血栓形成后，速用10%多聚甲醛溶液后固定24h。自視交叉前后2mm做冠狀切片，制成4mm厚的腦片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，用切片機(jī)做冠狀切片，制成切片厚度3～5μm的腦組織切片。對(duì)切片進(jìn)行HE染色及C3免疫組化染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察C3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。每個(gè)標(biāo)本在高倍光鏡（200倍）隨機(jī)觀察額頂葉和紋狀體內(nèi)外側(cè)不重疊的6個(gè)視野，計(jì)算各陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。陽(yáng)性結(jié)果為細(xì)胞胞漿被染成棕黃色顆粒狀。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（s）表示，應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析（one way analysis of variance，One－way ANOVA），兩兩比較采用最小顯著差（the least significant difference，LSD）t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1亞低溫對(duì)腦缺血后大鼠神經(jīng)功能的影響本實(shí)驗(yàn)中，假手術(shù)組大鼠未見神經(jīng)功能缺損。常溫組及亞低溫組造模成功的大鼠均有不同程度的神經(jīng)功能缺損，兩組大鼠神經(jīng)功能缺損均在3d時(shí)最明顯，7d時(shí)均有所減輕。除6h外各時(shí)間點(diǎn)亞低溫組大鼠神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較常溫組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分 （s）

表1 各時(shí)間點(diǎn)神經(jīng)功能評(píng)分 （s）

注：▲與常溫組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＞0.05，★與常溫組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，★★與常溫組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01

時(shí)間假手術(shù)組 常溫組 亞低溫組n（只）評(píng)分（分）n（只）評(píng)分（分）n（只）評(píng)分（分）6h 4 0 7 1.29±0.488 7 1.14±0.378▲1d 4 0 6 2.17±0.408 6 1.50±0.548★2d 4 0 6 2.67±0.516 7 1.86±0.690★3d 4 0 6 2.83±0.408 7 2.14±0.378★★7d 4 0 6 2.33±0.516 6 1.33±0.516★★

2.2 亞低溫對(duì)腦缺血后腦組織病理學(xué)改變的影響 （1）假手術(shù)組：神經(jīng)元胞體豐滿，胞核居中。毛細(xì)血管無充血擴(kuò)張，血管周圍間隙正常。（2）常溫6h組：缺血中心區(qū)皺縮神經(jīng)元明顯增多并呈三角形，嗜酸性變。腫脹的膠質(zhì)細(xì)胞增多，血管周圍水腫和滲出加重，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。（3）常溫1d～常溫3d組：缺血范圍擴(kuò)大。神經(jīng)元數(shù)目明顯減少，缺血區(qū)皺縮神經(jīng)元隨時(shí)間延長(zhǎng)增多，細(xì)胞核濃染，固縮，消失，部分神經(jīng)元胞漿淡染?？梢娔z質(zhì)細(xì)胞增多，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張，細(xì)胞周圍間隙增大。缺血灶周圍可見較多中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，第3天最明顯。（4）常溫7d組：神經(jīng)元胞漿嗜酸性，胞核深染，細(xì)胞間質(zhì)疏松。膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯，有膠質(zhì)結(jié)節(jié)形成。少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，組織水腫不明顯，壞死區(qū)與正常腦組織有清楚分界，周邊部有散在神經(jīng)元。（5）亞低溫組：與常溫組相比，皺縮神經(jīng)元數(shù)目減少，膠質(zhì)細(xì)胞腫脹較輕，血管周圍水腫和滲出較輕。中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)較少。

2.3 亞低溫對(duì)腦缺血后C3表達(dá)的影響 陽(yáng)性細(xì)胞可見于神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞。假手術(shù)組腦組織可見有少量C3表達(dá)。與假手術(shù)組相比，常溫組和亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)大鼠缺血側(cè)腦組織中均有大量C3表達(dá)，由于梗死灶內(nèi)大量細(xì)胞壞死，陽(yáng)性表達(dá)以梗死灶周邊明顯。假手術(shù)組腦組織各時(shí)間點(diǎn)少量C3表達(dá)之間的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。常溫組和亞低溫組缺血側(cè)腦組織于缺血后6h補(bǔ)體C3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開始增加，至3d達(dá)到高峰，到7d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。與常溫組相比，亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3表達(dá)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表2。

表2 各時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3表達(dá)細(xì)胞數(shù) （s）

表2 各時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3表達(dá)細(xì)胞數(shù) （s）

注：#術(shù)后6h時(shí)3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)＝204.341，P＝0.000，※術(shù)后1d時(shí)3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)＝471.402，P＝0.000，◆術(shù)后2d時(shí)3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)＝963.136，P＝0.000，□術(shù)后3d時(shí)3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)＝3032.097，P＝0.000，▼術(shù)后7d時(shí)三組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)＝302.424，P＝0.000?！窦偈中g(shù)組各時(shí)間點(diǎn)相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)＝0.093，P＝0.985，★各時(shí)間點(diǎn)與假手術(shù)組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01，▲各時(shí)間點(diǎn)與常溫組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01

時(shí)間 假手術(shù)組n（只）細(xì)胞數(shù)（個(gè)）常溫組n（只）細(xì)胞數(shù)（個(gè)）亞低溫組n（只）細(xì)胞數(shù)（個(gè)）6h 4 4.67±2.297#● 7 17.50±2.662#★ 7 15.48±2.616#★▲1d 4 4.88±2.112※● 6 23.89±2.447※★ 6 19.08±2.500※★▲2d 4 5.00±2.085◆● 6 34.17±2.646◆★ 7 25.50±2.770◆★▲3d 4 4.75±2.192□● 6 60.19±2.713□★ 7 36.36±2.945□★▲7d 4 4.71±2.255▼● 6 20.81±2.713▼★ 6 8.00±2.449▼★▲

圖1 為常溫6h組缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3的表達(dá)（SABC法×200）

圖2 為亞低溫6h組缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3的表達(dá)（SABC法×200）

圖3 為常溫3d組缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3的表達(dá)（SABC法×200）

圖4 為亞低溫3d組缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3的表達(dá)（SABC法×200）

圖5 為常溫7d組缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3的表達(dá)（SABC法×200）

圖6 為亞低溫7d組缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3的表達(dá)（SABC法×200）

3 討論

上世紀(jì)80年代，人們發(fā)現(xiàn)如果腦溫低于正常值的（2℃～6℃），能夠?qū)θ毖X組織起到明顯的保護(hù)作用，而且沒有嚴(yán)重的并發(fā)癥［2］。Reith［3］證實(shí)，亞低溫能夠降低死亡率改善病人的預(yù)后。Zausinger［4］研究顯示：在腦缺血－再灌注24h，亞低溫組大鼠腦梗死灶體積較常溫組明顯縮小，神經(jīng)功能缺損程度也較常溫組有明顯改善，表明亞低溫干預(yù)對(duì)腦缺血具有明顯神經(jīng)保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究光鏡下觀察，與常溫組相比，各時(shí)間點(diǎn)亞低溫組大鼠缺血灶神經(jīng)元死亡數(shù)目少，膠質(zhì)細(xì)胞腫脹較輕，血管周圍水腫和滲出較輕，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)輕。常溫組和亞低溫組大鼠神經(jīng)功能缺損3d時(shí)最明顯，7d時(shí)均有所減輕。除6h外各時(shí)間點(diǎn)亞低溫組動(dòng)物神經(jīng)功能缺損評(píng)分均較常溫組低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。這與以上的研究結(jié)果基本一致，提示亞低溫能減輕腦缺血的病理?yè)p傷，減輕神經(jīng)功能缺損，對(duì)局灶性腦缺血具有明顯的腦保護(hù)作用。

關(guān)于亞低溫腦保護(hù)作用機(jī)制方面的研究在許多方面已取得豐碩的研究成果，但目前尚未見有關(guān)亞低溫與C3關(guān)系的報(bào)道。補(bǔ)體第三組分（C3）是補(bǔ)體系統(tǒng)的核心，它是1912年Ritg用蛇毒處理血清時(shí)發(fā)現(xiàn)的。在補(bǔ)體各成分中，C3血清含量最高；在功能上，C3亦居于中心地位，它既是幾條激活途徑的交匯，又是C3b依賴性陽(yáng)性反饋環(huán)路的基礎(chǔ)；同時(shí)，C3裂解片段及其結(jié)合蛋白復(fù)雜而多樣。近年來，研究者發(fā)現(xiàn)補(bǔ)體系統(tǒng)參與缺血性腦血管疾病病理生理過程。梁麗貞等［5］實(shí)驗(yàn)證明腦缺血－再灌注后補(bǔ)體激活參與其損傷過程。Mocco等［6］發(fā)現(xiàn)C1q缺陷鼠，C3缺陷鼠和C5缺陷鼠在短暫的局部腦缺血時(shí)，僅C3缺陷鼠受到保護(hù)，C3缺陷鼠梗塞體積小，中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)少，氧自由基生成少。Atkinson等［7］實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)與野生小鼠相比，C3缺陷小鼠在腦缺血再灌注24h后存活率高，梗死面積小，并且沒有測(cè)到有P選擇素蛋白表達(dá)，白細(xì)胞浸潤(rùn)少，微血栓形成少，血流量大。以上研究均說明補(bǔ)體C3在腦缺血的病理生理過程中起著關(guān)鍵作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)局灶性腦缺血大鼠病變側(cè)腦組織神經(jīng)元，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞有C3表達(dá)，且在缺血后6 h補(bǔ)體C3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開始增加，至3d達(dá)到高峰，到7d時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。這與相關(guān)的研究結(jié)果基本一致［8］，進(jìn)一步證實(shí)了C3參與了缺血性腦損害的病理生理過程。

Cowell［9］發(fā) 現(xiàn) 用 眼 鏡 蛇 毒 因 子 （cobra venom factor，CVF）去除補(bǔ)體，可以減輕新生鼠缺氧缺血性腦損傷的損傷體積，和損傷的神經(jīng)元C3的沉積。劉立［10］等用CVF消耗大鼠體內(nèi)補(bǔ)體后，腦缺血區(qū)域內(nèi)中性粒細(xì)胞數(shù)減少，腦組織損傷程度減輕。Hua［11］等研究發(fā)現(xiàn)，肝素和N－乙酰肝素通過增強(qiáng)C1抑制劑（C1inhibitor，C1－INH）的活性和抑制C3轉(zhuǎn)化酶的活性，阻止補(bǔ)體激活，亦具有與CVF類似的作用。以上研究表明，腦缺血時(shí)一些藥物通過降低C3的表達(dá)起腦保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究表明常溫組和亞低溫組于缺血后6h補(bǔ)體C3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均開始增加，至3d均達(dá)到高峰，到7d時(shí)C3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少。與常溫組相比，亞低溫組各時(shí)間點(diǎn)缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體C3表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這提示腦缺血后亞低溫能明顯下調(diào)C3的表達(dá)，亞低溫可能通過降低C3的表達(dá)減輕補(bǔ)體級(jí)聯(lián)反應(yīng)起到腦保護(hù)作用。

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