孔慶彧，崔久嵬，于得海，李 薇，王雪梅，2，王冠軍＊

（1．吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春130021；2．吉林省人民醫(yī)院 血液科）

肺癌為死亡率最高的惡性腫瘤之一，在全世界范圍內(nèi)死亡率仍呈逐年上升趨勢。近年來隨著對腫瘤發(fā)生研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)并證實腫瘤發(fā)生與轉(zhuǎn)移根本原因在于相關(guān)基因的異常表達(dá)，尤其是調(diào)控細(xì)胞生長與分化的癌基因的激活或抑癌基因的失活更成為腫瘤發(fā)生機制研究的熱點［1］。COPS3（constitutive photomorphogenic homolog subunit 3 of COP9）是新近發(fā)現(xiàn)的一種與腫瘤發(fā)生及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的基因，是腫瘤治療的潛在靶點。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種高效、特異地降解靶基因mRNA的實驗技術(shù)，目前已廣泛應(yīng)用于基因功能領(lǐng)域的研究［2，3］。

本研究通過建立COPS3慢病毒RNAi載體，觀察干擾COPS3基因表達(dá)后，肺癌細(xì)胞A549增殖、周期分布及細(xì)胞凋亡情況，以探討其在肺癌發(fā)展中的作用。

1 材料與方法

1．1 主要材料

人肺腺癌細(xì)胞株A549、人胚胎腎上皮細(xì)胞株293T（ATCC）；表達(dá)載體 pFH1UGW－GFP（上海Hollybio公司）；慢病毒載體及輔助載體（上海吉凱基因 技 術(shù) 公 司）；M－MLV 反 轉(zhuǎn) 錄試劑 盒 （Promega）；ECL試劑（Amersham）；COPS3兔抗小鼠單克隆抗體、β－actin兔抗小鼠多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠抗抗體（Snata Cruz）。

1．2 COPS3基因的RNA干擾

1．2．1 RNAi慢病毒載體構(gòu)建 針對COPS3基因mRNA序列，通過“Target Finder Tool”軟件（Gen－Scrip）設(shè)計干擾序列及對照序列（表1）。單鏈DNA退火后產(chǎn)生雙鏈DNA oligo，再與雙酶切后的慢病毒干擾載體連接，進(jìn)而轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑單克隆進(jìn)行PCR鑒定；對陽性菌落進(jìn)行測序。

1．2．2 慢病毒包裝及感染細(xì)胞 293T細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時開始轉(zhuǎn)染，參照Lipofectamine 2000說明書，在6孔板中加入si－COPS3或si－CTRL 2 μg、pCMV載體1．5μg、pVSVG載體1μg。轉(zhuǎn)染后8h更換正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h，在此期間觀察轉(zhuǎn)染效率。最后收集上清液，進(jìn)行過濾、濃縮并測定病毒滴度。

表1 COPS3基因干擾序列

以5×104細(xì)胞／孔將A549細(xì)胞接種于96孔板，以含有適量病毒的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72h，在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

1．2．3 慢病毒感染后COPS3基因沉默分析 收集慢病毒感染5d的A549細(xì)胞，分別應(yīng)用real－time PCR及Western blot法分析檢測慢病毒感染A549細(xì)胞后COPS3mRNA及蛋白表達(dá)水平。

1．3 BrdU法檢測細(xì)胞增殖

收集慢病毒感染5d的A549細(xì)胞，按5×103細(xì)胞／孔接種于96孔板，檢測時間設(shè)為接種后24h和72h。調(diào)整每孔BrdU終濃度為25μmol／l，繼續(xù)培養(yǎng)8h，固定細(xì)胞并用核酸酶室溫消化30min后加入BrdU單克隆抗體（1∶200稀釋）與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠二抗，室溫孵育1．5h，然后加入TMB顯色底物，暗處孵育30min后終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀讀取490nm處OD值。

1．4 細(xì)胞周期分析

收集慢病毒感染細(xì)胞以1×106個細(xì)胞／孔接種于6孔板，培養(yǎng)24h后收集細(xì)胞并固定，加入配制的PI溶液（100μg／ml PI，10μg／ml RNase A）染色30min。應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1．5 細(xì)胞凋亡檢測

取慢病毒感染細(xì)胞以5×105個細(xì)胞／孔接種于6孔板，培養(yǎng)5d，消化并收集細(xì)胞，分別加入100μl結(jié)合緩沖液、5μl Annexin V 溶液及5μl PI，于暗處室溫孵育5min。取1×106個細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。

1．6 統(tǒng)計數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以平均值ˉx±SD表示，每組實驗重復(fù)三次。數(shù)據(jù)采用SPSS16．0軟件進(jìn)行pairedt檢驗，P≤0．05認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 慢病毒感染A549細(xì)胞

將慢病毒感染A549細(xì)胞96h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況，可見明顯綠色熒光，證明病毒表達(dá)質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，感染效率可達(dá)50%以上（圖1）。

圖1 慢病毒感染A549細(xì)胞96h后GFP表達(dá)情況（×200）

2．2 RNAi COPS3基因沉默效果驗證

與對照組相比，轉(zhuǎn)染si－COPS3的A549細(xì)胞COPS3mRNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平均顯著下降（圖2，3）。

2．3 干擾COPS3表達(dá)對A549細(xì)胞增殖的影響

BrdU細(xì)胞增殖實驗結(jié)果表明，與對照組相比，si－COPS3轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞72h后細(xì)胞增殖顯著受抑（圖4）。

圖2 Real－time PCR分析轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后A549細(xì)胞COPS3mRNA表達(dá)情況

圖3 Western blot分析轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后A549細(xì)胞COPS3蛋白質(zhì)表達(dá)水平

圖4 BrdU法分析干擾COPS3基因表達(dá)后A549細(xì)胞增殖情況

2．4 COPS3基因沉默對A549細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果表明，與對照組不同，COPS3基因沉默后細(xì)胞周期大多停滯于G0／G1期（圖5A、B）。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)分析干擾COPS3基因后A549細(xì)胞周期情況（A）及其定量分析（B）

2．5 COPS3基因沉默對A549細(xì)胞凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)分析經(jīng) Annexin V－PI雙染后的A549細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示，實驗組凋亡細(xì)胞比例均顯著高于對照組（圖6A、B）。

圖6 流式細(xì)胞術(shù)分析干擾COPS3基因后A549細(xì)胞凋亡情況

3 討論

近年來，腫瘤治療分子靶點的探索及相應(yīng)藥物研發(fā)成為抗腫瘤新藥研發(fā)的前沿和熱點［3］。

COPS3基因是高度保守COP9信號傳導(dǎo)通路中的一部分，位于人染色體17p11．2。該基因能調(diào)控細(xì)胞內(nèi)諸多生物學(xué)過程，包括細(xì)胞周期、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和轉(zhuǎn)移等［4，5］。Dartel等［5］通過 DNA微陣列法亦發(fā)現(xiàn)COPS3基因在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)；Yan等［6］研究發(fā)現(xiàn)該基因在高度惡性骨肉瘤組織中高表達(dá)，而當(dāng)COPS3過表達(dá)后抑制p53基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長，敲除COPS3基因后，可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖。

慢病毒載體具有十分廣泛的宿主范圍，分裂期及非分裂細(xì)胞均能感染，并且能夠?qū)⑤^大的外源基因片段有效地整合至宿主基因組中，是目前較為理想的基因轉(zhuǎn)移載體之一［7］。本實驗以慢病毒為載體，成功建立了COPS3的干擾體系，并將其導(dǎo)入肺癌細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)通過干擾COPS3基因表達(dá)，肺癌細(xì)胞增殖能力受到明顯抑制，并可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯于G0／G1期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示COPS在肺癌發(fā)生發(fā)展中可能起到重要的作用。

本研究為進(jìn)一步深入探討COPS3基因沉默后在肺癌發(fā)生與發(fā)展過程中的機制奠定了實驗基礎(chǔ)。

［1］Skrzypski M，Dziadziuszko R，Jassem J．MicroRNA in lung cancer diagnostics and treatment［J］．Mutat Res，2011，717（1）：25．

［2］Halimi Y，Dessau M，Pollak S，et al．COP9signalosome subunit 7 from Arabidopsis interacts with and regulates the small subunit of ribonucleotide reductase（RNR2）［J］．Plant Mol Biol．，2011，77（1－2）：77．

［3］Emanuele MJ，Creighton CJ，Schlabach MR，et al．A genome－wide RNAi screen identifies multiple synthetic lethal interactions with the Ras oncogene［J］．Cell，2009，137（5）：835．

［4］Fuchs B，Pritchard DJ．Etiology of osteosarcoma［J］．Clin Orthop Relat Res，2002，397（4）：40．

［5］van Dartel M，Cornelissen PW，Redeker S，et al．Amplification of 17p11．2approximately p12，including PMP22，TOP3A，and MAPK7，in high－grade osteosarcoma［J］．Cancer Genet Cytogenet，2002，139（2）：91．

［6］Yan T，Tang G，Ren T，et al．RNAi－mediated COPS3gene silencing inhibits metastasis of osteogenic sarcoma cells［J］．Cancer Gene Ther．2011，18（6）：450．

［7］Cockrell AS，Kafri T．Gene delivery by lentivirus vectors［J］．Mol Biotechnol，2007，36（3）：184．